UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ STUDIUL ACTIVITĂŢII UNOR ENZIME HIDROLITICE UTILIZATE ÎN BIOTEHNOLOGIILE VEGETALE

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ ŞCOALA DOCTORALĂ ZOOTEHNIE ŞI BIOTEHNOLOGII CRISTEA ADINA-ANCUŢA (CHIŞ) STUDIUL ACTIVITĂŢII UNOR ENZIME HIDROLITICE UTILIZATE ÎN BIOTEHNOLOGIILE VEGETALE REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof. Dr. Carmen SOCACIU Cluj-Napoca 2011

CUPRINS INTRODUCERE... 3 CERCETĂRI PROPRII... 4 1. APLICAŢII ALE SPECTROSCOPIEI FT-MIR ÎN DETERMINAREA RAPIDĂ A ACTIVITĂŢII UNOR ENZIME HIDROLITICE PE SUBSTRAT DE CĂTINĂ (HIPPOPHAE RHAMNOIDES L.)... 4 MATERIALE ŞI METODE... 4 REZULTATE ŞI DISCUŢII... 5 Regiunile FT-MIR specifice şi curbele de calibrare pentru glucoză, fructoză, zaharoză, ramnoză şi acidul galacturonic... 5 Spectrele FT-MIR şi regiunile de fingerprint specifice sucului de cătină obţinut (cu sau fără tratament enzimatic)... 6 Evaluarea cantitativă a glucozei, fructozei, ramnozei, zaharozei şi acidului galacturonic ca principali produşi de hidroliză a enzimelor hidrolitice... 8 2. STUDII COMPARATIVE DE HIDROLIZĂ ENZIMATICĂ PE SUBSTRAT DE MĂR (MALUS DOMESTICA)... 9 MATERIALE ŞI METODE... 9 REZULTATE ŞI DISCUŢII... 10 Spectrele FT-MIR şi regiunile de fingerprint specifice sucului de măr obţinut cu sau fără tratament enzimatic... 10 Studii de analiză cantitativă a principalilor produşi de hidroliză a enzimelor hidrolitice utilizând spectroscopia FT-MIR cuplată cu metode chemometrice... 11 Concentraţiile prezise pe baza modelelor de regresie PLS pentru glucidele din sucul de măr... 11 Studii de analiză cantitativă, prin cromatografie HPLC, a principalilor produşi rezultaţi prin hidroliză enzimatică... 16 Studii de analiză calitativă prin metoda principalelor componente (PCA)... 18 3. STUDII COMPARATIVE DE HIDROLIZĂ ENZIMATICĂ PE SUBSTRAT DE SFECLĂ DE ZAHĂR (BETA VULGARIS)... 20 MATERIALE ŞI METODE... 20 REZULTATE ŞI DISCUŢII... 21 Spectrele FT-MIR şi regiunile de fingerprint specifice sucului de sfeclă de zahăr obţinut cu sau fără tratament enzimatic... 21 Studii de analiză cantitativă a principalilor produşi de hidroliză a enzimelor hidrolitice utilizând spectroscopia FT-MIR cuplată cu metode chemometrice... 25 Construirea modelelor de calibrare pentru glucoză, fructoză, ramnoză, zaharoză şi acidul galacturonic pe baza regresiei parţiale prin pătrate mici (PLS)... 25 Concentraţiile prezise pe baza modelelor de regresie PLS pentru carbohidraţii din sucul de sfeclă de zahăr... 27 Studii de analiză cantitativă a principalilor produşi de hidroliză a enzimelor hidrolitice prin cromatografie HPLC... 31 Studii de analiză calitativă prin metoda principalelor componente (PCA)... 32 CONCLUZII GENERALE... 34 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ... 36 2

INTRODUCERE Datorită progreselor în biotehnologii din ultimii ani, progrese ce vizează înlocuirea şi optimizarea unor procese şi tehnologii tradiţionale aplicate în diverse domenii, enzime cum ar fi celulazele, hemicelulazele şi pectinazele au fost şi sunt în mod continuu investigate datorită potenţialelor lor aplicaţii în diverse industrii, cum ar fi cea alimentară, textilă, a detergenţilor, etc. (Bhat M. K., 2000; Hoondal G. S. şi col., 2000). Aplicaţii ale spectroscopiei în infraroşu cu transformantă Fourier (FT-IR) în procesul de evaluare a activităţii enzimatice au fost raportate în literatura de specialitate (Pacheco R. şi col., 2003; Lendl B. şi col., 1998; Schindler R. şi col., 1998; Schindler R. şi col., 1997; Krieg P. şi col., 1996; Cadet F. şi col., 1995). Utilizarea spectroscopiei în infraroşu (IR) permite eliminarea reacţiilor secundare sau de separare în vederea monitorizării activităţii enzimatice, datorită benzilor de absorbţie specifice în domeniul middle infraroşu, furnizând astfel informaţii moleculare specifice asupra substratului şi produşilor de reacţie. Scopul acestei teze de doctorat a fost acela de a testa posibilitatea evaluării activităţii enzimatice a diferitelor preparate enzimatice pe substrat de cătină, măr şi sfeclă de zahăr prin spectroscopie FT-MIR şi validarea rezultatelor obţinute prin cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC). În vederea atingerii acestui scop, obiective principale au fost: Caracterizarea spectrelor FT-MIR înregistrate pentru sucul de cătină, măr şi sfeclă de zahăr în cazul probelor tratate enzimatic comparativ cu probele control (netratate enzimatic), stabilindu-se totodată şi regiunile de fingerprint specific fiecărui substrat. Evaluarea activităţii enzimatice a diferitelor tipuri de pectinaze, celulaze şi hemicelulaze prin determinarea cantitativă a produşilor rezultaţi în urma acţiunii acestora prin cuplarea spectroscopiei FT-MIR cu metoda chemometrică a regresiei PLS ( partial least squares regression ). Stabilirea condiţiilor optime de acţiune pentru fiecare tip de preparat enzimatic şi pe fiecare tip de substat utilizat. Studii de analiză calitativă a datelor obţinute prin FT-MIR, utilizând metoda chemometrică a analizei principalelor componente (PCA). Validarea rezultatelor cantitative obţinute prin spectroscopie FT-MIR şi regresie PLS prin metoda HPLC. Structura tezei: teza este structurată în două mari părţi, şi anume Studiu de literatură (Partea I) şi Contribuţii personale (Partea II). Prima parte include două capitole (1-2): v Capitolul 1 trece în revistă diferite aspecte ale enzimelor hidrolitice şi substratelor asupra cărora acţionează, şi anume ale pectinazelor, celulazelor şi hemicelulazelor, aspecte ce se referă în special la structura chimică, clasificare, funcţii şi aplicaţii biotehnologice. v În Capitolul 2 sunt redate aspecte generale şi diverese aplicaţii ale spectroscopiei în infraroşu, în special ale FT-MIR. Partea a doua cuprinde patru capitole (3-5): v Capitolul 3 se referă la studii de hidroliză enzimatică realizate pe substrat de cătină. v Capitolul 4 include studii ale activităţii enzimatice a pectinazelor, celulazelor şi hemicelulazelor pe substrat de măr prin spectroscopie FT-MIR şi validarea rezulatelor prin HPLC. 3

v În Capitolul 5 sunt prezentate rezultatele hidrolizei substanţelor pectice, celulozice şi hemicelulozice pe substrat de sfeclă de zahăr, rezultate obţinute prin spectroscopie FT-MIR şi HPLC. v În final sunt redate concluziile generale privind rezultatele obţinute prin FT-MIR şi HPLC asupra celor trei substrate amintite mai sus. CERCETĂRI PROPRII 1. APLICAŢII ALE SPECTROSCOPIEI FT-MIR ÎN DETERMINAREA RAPIDĂ A ACTIVITĂŢII UNOR ENZIME HIDROLITICE PE SUBSTRAT DE CĂTINĂ (HIPPOPHAE RHAMNOIDES L.) MATERIALE ŞI METODE Enzimele utilizate în acest studiu au fost reprezentate de preparatele comerciale Carezyme 1000 L (1000 U/g) şi Pectinex Ultra SP-L (9.500U-ml) (Sigma Aldrich). Primul preparat conţine exclusiv activitate celulazică (celulaze provenite din Aspergillus sp.), în timp ce al doilea (pectinaze şi hemicelulaze din Aspergillus aculeatus) conţine atât activitate pectinazică, cât şi celulazică, cea pectinazică fiind acivitatea principală. În vederea asigurării ph-ului optim de acţiune (4,2) s-a utilizat tamponul acetat Fructele de cătină (SB) utilizate în acest studiu au fost colectate din flora spontană a judeţului Cluj (Transilvania, Nordul Romaniei) şi păstrate la - 20 C până în momentul utilizării. Fructele dezgheţate au fost macerate cu ajutorul unui blender, iar piureul obţinut a fost împărţit în patru probe, o probă control (netratată enzimatic) şi trei probe tratate cu enzimele luate în studiu. Fiecare probă a costat din 15 g piure de fructe de cătină şi 7 ml tampon acetat (ph 4.2). Tratamentul enzimatic s-a făcut conform tabelului de mai jos (Tabel 1.1). Tabel 1.1 Tipul de enzime comerciale utilizate pentru hidroliza piureului de cătină şi raporturile faţă de substrat Table 1.1 Type of commercial enzymes used to hydrolyze the SB puree and their specific ratios to substate Cantitatea şi tipul de enzimă Raportul enzimă:substrat Quantity and type of enzymes Ratio enzyme:substrate 1 ml Celulaze (C) 1000 U C:15 g piure de cătină 0,3 ml - Pectinaze şi Hemicelulaze (PHC) 2850 U PHC:15 g piure de cătină 1 ml Celulaze şi 0,3 ml Pectinaze şi Hemicelulaze 1000 U C şi 2850 U PHC:15 g piure de cătină (CPHC) - 15 g piure de cătină După adăugarea enzimei, toate probele (inclusiv controlul) au fost agitate, iar apoi incubate timp de 24 h la 40 C. După 24 h probele au fost centrifugate de trei ori câte 15 min la 4000 rpm (centrifuga Jouan, Franţa). Supernatantul corespunzător fiecărei probe a fost colectat şi filtrat pe hârtie de filtru Whatman, acesta fiind mai departe uilizat pentru măsurătorile spectrometrice. Toate măsurătorile FT-MIR au fost realizate utilizând spectrometrul FT-MIR (Shimadzu Prestige 2, Apodization: Happ-Genzel). Pentru fiecare spectru întregistrat în regiunea MIR, 4000-500 cm -1, s-au acumulat 64 de scanări, utilizându-se sistemul orizontal de atenuare a reflexiei (Horizontal Attenuated Total Reflection) (HATR). 4

Au fost preparate o serie de soluţii standard de glucoză (1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 şi 25 g/100 ml), fructoză (3, 4, 5, 7, 10, 15, 20 şi 25 g/100 ml), zaharoză (1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 şi 25 g/100 ml), ramnoză (2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 18 şi 20 g/100 ml) şi acid galacturonic (0,5, 1, 2, 3, 4 şi 5 g/100 ml) care au fost apoi analizate la spectrometrul FT-MIR în aceleaşi condiţii ca şi probele de cătină. Datele primare obţinute au fost prelucrate cu ajutorul programelor IRsolution Software Overview (Shimadzu) şi Origin R 7SR1 Software (OriginLab Corporation, Northampton, USA). Ca şi test statistic s-a utilizat testul ANOVA. REZULTATE ŞI DISCUŢII Regiunile FT-MIR specifice şi curbele de calibrare pentru glucoză, fructoză, zaharoză, ramnoză şi acidul galacturonic După cum se observă în figura 1.1 (a), spectrele FT-MIR (4000-700 cm -1 ) ale soluţiilor standard de glucoză (20%), fructoză (20%), zaharoză (20%) şi ramnoză (20%) sunt foarte bine definite şi prezintă benzi de absorbţie specifice în regiunea de fingerprint (F) (1200-900 cm -1 ) (Fig. 1.1 (b)). (a) (b) Fig. 1.1. (a) Spectrele FT-MIR integrale (4000-700 cm -1 ) ale soluţiilor standard apoase de glucoză (20%), fructoză (20%), zaharoză (20%) şi ramnoză (20%). (b) Peak-urile specifice din regiunea de fingerprint (F) (1200-900 cm -1 ) ale spectrelor normalizate (1200 cm -1 ) Fig. 1.1. (a) The integral FT-MIR spectra (4000-700 cm -1 ) of aqueous standard solutions of glucose (20%), fructose (20%), sucrose (20%) and rhamnose (20%). (b) Specific peaks in the fingerprint region (F) (1200-900 cm -1 ) of the normalized spectra (1200 cm -1 ) Se observă că regiunea de fingerprint a celor patru compuşi analizaţi se află între frecvenţele 1200-900 cm -1. În acesată regiune apar peak-uri caracteristice pentru fiecare compus. Pentru glucoză, regiunea de fingerprint (1200-900 cm -1 ) include benzi caracteristice cu absorbţii la 991, 1033, 1078 şi 1149 cm -1, peak-ul din jurul frecvenţei de 1033 cm -1 prezentând intensitatea cea mai mare şi fiind considerat peak-ul caracteristic acestui compus. În cazul fructozei, peak-urile caracteristice regiunii de fingerprint (1200-900 cm -1 ) apar la 966, 979, 1063, 1082 cm -1, iar peak-ul specific este considerat cel de la 1063 cm -1. Ramnoza, ce intră în structura substanţelor pectinice, prezintă în regiunea de fingerprint (1200-900 cm -1 ) benzi caracteristice cu maximum de absorbţie la 979, 1020, 1068, 1124 şi 1178 cm -1, peak-ul caracteristic fiind considerat cel de la 1068 cm -1. Zaharoza prezintă benzi de absorbţie la 995, 1053 şi 1136 cm -1, peak-urile 995 şi 1053 cm -1 apărând în raport de 1:1. 5

Atât spectrele FT-MIR, cât şi regiunea de fingerprint a acidului galacturonic sunt diferite de cele ale glucozei, fructozei, ramnozei şi zaharozei, după cum se observă în figura 1.2 (a) şi (b). Fig. 1.2. (a) Spectrul FT-MIR integral (4000-700 cm -1 ) al soluţiei standard apoase de acid galacturonic 5%. (b) Preak-urile specifice în regiunea de fingerprint (F) (1500-700 cm -1 ) Fig. 1.2. (a) The integral FT-MIR spectrum(4000-700 cm -1 ) of aqueous standard solution containing 5% galacturonic acid. (b) Specific peaks in the fingerprint region (F) (1500-700 cm -1 ). Regiunea de fingerprint a acidului galacturonic (Fig. 1.2 (b)) este mult mai largă decât a celorlalţi carbohidraţi, şi anume 1500-700 cm -1. Peak-urile specifice pentru acidul galacturonic sunt 1340, 1217, 1143, 1066, 1018, 968 şi 806, peak-ul caracteristic fiind considerat 1018 cm - 1 (Fig. 1.2 (b)). Pe baza datelor obţinute în urma înregistrării spectrelor FT-MIR pentru compuşii amintiţi mai sus, s-au elaborate curbe de calibrare pentru fiecare dintre aceştia. Astfel, curbele de calibrare au fost elaborate pe baza intensităţii peak-urilor considerate caracteristice pentru fiecare carbohidrat: glucoză 1033 cm -1, fructoză 1063 cm -1, ramnoză 1068 cm -1, zaharoză 995 cm -1, acid galacturonic 1018 cm -1. Curbele astfel elaborate, au fost utilizate pentru determinarea cantitativă a acestor compuşi în probele de suc de cătină analizate. Spectrele FT-MIR şi regiunile de fingerprint specifice sucului de cătină obţinut (cu sau fără tratament enzimatic) În figura 1.3 (a) şi (b) sunt redate spectrele FT-MIR integrale (4000-700 cm -1 ) şi regiunile de fingerprint (1200-950 cm -1 ) specifice sucului de cătină obţinut în urma unui tratament prealabil cu C, PHC şi CPHC, comparativ cu sucul obţinut fără tratament enzimatic (control). 6

(a) (b) Fig. 1.3. (a) Spectrele FT-MIR (4000-700 cm -1 ) ale sucului de cătină obţinut, cu sau fără tratament enzimatic. (b) Regiunea de fingerprint specifică sucului de cătină (1200-950 cm -1 ) (în fig. A indicat prin F). Fig. 1.3. (a) The FT- MIR spectra (4000-700 cm -1 ) of the sea buckthorn juice obtained with and without enzymatic treatment. (b) The specific fingerprint region of sea buckthorn juice (1200-950 cm -1 ) (in A indicated by the inserted F). Spectrele FT-MIR ale sucului de cătină obţinut cu sau fără tratament enzimatic prezintă trei zone de absorbţie: 3700-2850 cm -1 (I), 1800-1200 cm -1 (II) şi regiunea de fingerprint (1200-950 cm -1 ) (F) (Fig. 1.3 (a) şi (b)). În cadrul primei regiuni (3700-3000 cm -1 ), apar peak-uri corespunzătoare apei, respectiv şi grupării OH. În cadrul aceleiaşi regiuni, zona dintre 2980 şi 2850 cm -1, corespunde vibraţiilor de întindere a legăturilor C H din interiorul grupărilor CH 3 sau CH 2. Regiunea a doua (1800-1200 cm -1 ) corespunde absorbţiilor date de grupările carbonil. Se observă că peak-ul major în această regiune este cel din jurul frecvenţei de 1635 cm -1, peak caracteristic întinderilor asimetrice ale legăturilor C = O şi COO din esteri (Copikova J. şi col., 2001). Tot în acestă zonă se observă apariţia peak-urilor 1397, 1338 şi 1273 cm -1. Primele două peak-uri, 1397 şi 1338 cm -1 sunt atribuite vibraţiilor date de legăturile C H din ciclurile piranozice din structura carbohidraţilor (Filippov M. P., 1978). Peak-ul 1273 cm -1 este un peak carecteristic substanţelor pectice şi apare datorită vibraţiilor date de grupările carboxil din structura acestora (Wellner N. şi col., 1998). Cea de-a treia regiune, 1200-950 cm -1, corespunde regiunii de fingerprint (F) a sucului de cătină. Glucoza, fructoza, ramnoza şi zaharoza prezintă peak-uri caracteristice în această regiune. Astfel, se observă (Fig. 1.3 (b)) că în cazul sucului de cătină obţinut fără un tratament prealabil cu enzime hidrolitice (control) în această regiune apare un singur peak bine definit, şi anume cel din jurul frecvenţei de 1070 cm -1, peak ce poate fi atribuit ramnozei din structura substanţelor polizaharidice. Spre deosebire de proba control, în cazul sucului de cătină obţinut în urma unui tratament enzimatic cu celulaze (C), se observă apariţia, pe lângă peak-ul 1070 cm -1, a două noi peak-uri, şi anume 1039 şi 1018 cm -1, caracteristice glucozei şi acidului galacturonic. În cazul probei tratate cu pectinaze şi hemicelulaze se observă că peak-ul caracteristic glucozei nu mai apare, apărând doar cele caracteristice ramnozei şi acidului galacturonic (1070 şi 1018 cm -1 ). În plus, mai apare un peak în jurul frecvenţei de 1149 cm -1 peak, de asemenea, caracteristic acidului galacturonic. În cazul în care s-a tratat piureul de cătină cu ambele preparate enzimatice (CPHC) se observă atât apariţia peak-ului caracteristic glucozei (în jur de 1037 cm -1 ) cât şi peak-ului caracteristic acidului galacturonic (1145 cm -1 ) şi ramnozei (1070 cm -1 ) din structura pereţilor celulari. 7

Evaluarea cantitativă a glucozei, fructozei, ramnozei, zaharozei şi acidului galacturonic ca principali produşi de hidroliză a enzimelor hidrolitice Pe baza datelor obţinute din curbele de calibrare ale glucozei, fructozei, ramnozei, zaharozei şi acidului galacturonic s-au calculat concentraţiile acestor glucide în sucul de cătină obţinut cu sau fără tratament enzimatic (Tabel 1.2). Tabel 1.2 Concentraţiile de glucoză (1033 cm -1 ), fructoză (1063 cm -1 ), ramnoză (1068 cm -1 ), zaharoză (995 cm -1 ) şi acid galacturonic (1018 cm -1 ) în sucul de cătină obţinut cu sau fără tratament enzimatic Table 1.2 The concentrations of glucose (1033 cm -1 ), fructose (1063 cm -1 ), rhamnose (1068 cm -1 ), sucrose (995 cm -1 ) and galacturonic acid (1018 cm -1 ) in sea buckthorn juce obtained with or without enzymatic treatment Proba/enzima Sample/enzyme Frecvenţa Wavenumber (cm -1 ) Control/Control 1033 0,212 1063 0,03 1068 0,619 995 0,62 1018 4,176 Celulaze/Cellulases (C) 1033 1,276 1063 1,201 1068 1,174 995 1,003 1018 4,226 Pectinaze şi hemicelulaze/pectinases and Hemicellulases (PHC) Celulaze, pecinaze şi hemicelulaze/cellulases, Pectinases and Hemicellulases Concentraţia Concentration (%) 1033 0,489 1063 0,513 1068 1,867 995 0,744 1018 4,391 1033 0,533 1063 0,480 1068 1,111 995 0,657 1018 4,255 Rezultatele obţinute sugerează faptul că activitatea acestor enzime este diferită în funcţie de raportul enzimă/substrat. Se pare că activitatea hidrolitică optimă, în acest caz se obţine când substratul este tratat individual cu aceste enzime, şi nu în combinaţie (Chiş A. şi col., 2010). De asemenea, se poate observa că în cazul glucozei şi fructozei, cele mai mari concentraţii (1,276%, respectiv 1,201%) au fost determinate în cazul probelor tratate cu celulaze. În probele tratate cu pectinaze şi hemicelulaze concentraţia glucozei a fost cea mai mică (0,489%), o concentraţie intermediară de 0,533%, înregistrându-se în cazul probelor tratate cu cele două preparate în amestec, demonstrând astfel acţiunea celulazelor din amestec. Cele mai mari concentraţii de acid galacturonic şi ramnoză, markeri ai degradării substanţelor pectinice, au fost înregistrate în cazul probelor tratate cu pectinaze şi hemicelulaze (1,867% - ramnoză, 4,391% - acid galacuronic). Cea mai slabă activitate enzimatică (evaluată pe baza compuşilor eliberaţi) s-a înregistrat în cazul probelor tratate cu amestecul CPHC. 8

2. STUDII COMPARATIVE DE HIDROLIZĂ ENZIMATICĂ PE SUBSTRAT DE MĂR (MALUS DOMESTICA) MATERIALE ŞI METODE În acest studiu au fost evaluate activităţile enzimatice a patru tipuri de pectinaze şi două tipuri de celulaze comerciale provenite de la firma AB Enzymes, Darmstadt, Germania: a) Rohament PL (RPL) (activitate pectinazică); b) Rohapect 10L (R10L) (activitate pectinazică); c) Rohapect PTE (RPTE) (activitate pectinazică); d) Rohapect DA6L (RDA6L) (activitate pectinazică); e) Rohapect B1L (RB1L) (activitate pectinazică şi hemicelulazică); f) Rohament CL (RCL) (activitate celulazică). ph-urile optime de acţiune al acestor enzime au fost asigurate de tamponul acetat cu ph de 3,9, în cazul enzimelor RPL, R10L, RPTE, RDA6L şi de 4,4 în cazul enzimelor RB1L şi RCL. Merele utilizate în acest studiu au provenit dintr-un supermarket din Cluj-Napoca, fiind pastrate la 4 C până în momentul prelucrării. În acest studiu s-au utilizat mere ce fac parte din soiul Red Star. Merele au fost decojite, tăiate în bucăţi mici şi macerate cu ajutorul unui blender. Piureul obţinut a fost împărţit în 57 probe, câte 9 probe pentru fiecare enzimă luată în studiu şi 3 probe control (netratate enzimatic). Fiecare probă a constat din 5 g piure de măr şi 7 ml tampon acetat, ph 3,9, respectiv 4,4. Pentru fiecare tip de enzimă s-a urmărit activitatea enzimatică la trei concentraţii diferite raportate la substrat şi anume 2,4, 12 şi 24 % şi trei timpi de incubare diferiţi (30 min, 3 şi 24 ore). După adăugarea enzimelor toate probele au fost agitate şi apoi incubate la 25 C. După 30 min, respectiv 3 h şi 24 h, probele au fost centrifugate de trei ori a câte 15 minute la 4000 rpm (centrifuga Jouan, Franţa). Supernatantul corespunzător fiecărei probe a fost colectat şi filtrat prin hîrtie de filtru Whatman, iar apoi păstrate la -20 C până în momentul efectuării analizelor spectroscopice FT-MIR şi prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC). Sucul de mere obţinut după centrifugări şi filtrări a fost analizat la spectofotometrul IR (Shimadzu Prestige 2, Apodization: Happ-Genzel). Pentru fiecare spectru înregistrat (pe domeniul 4000 500 cm -1 ) s-au utilizat 400 µl probă, acumulându-se 64 de scanări pentru fiecare probă, la o rezoluţie de 4 cm -1. După prelucrarea datelor obţinute prin spectroscopie FT-MIR, în vederea validării acestei metode ca una adecvată evaluării activităţii enzimatice a diferitelor preparate, probele considerate cele mai semnificative au fost analizate şi prin HPLC. Glucidele analizate au fost separate şi cuantificate utilizând un cromatograf Shimadzu, echipat cu un sistem HPLC ce conţine pompa binară de transport al solvenţilor, autosampler şi detector cu detecţie cu reţea de fotodiode (PDA). Separarea cromatografică a acestor glucide s-a făcut pe o coloană C18 Altima Amino modificată (250 x 4.6 mm). Eluţia s-a realizat prin 300C, cu un solvent izoacritic, acetonitril:apă (80:20 v/v) la o constantă de curgere de 1.3 ml/min. Glucoza, frucoza, ramnoza, zaharoza şi acidul galacturonic au fost identificate pe baza timpului lor de retenţie din soluţiile standard preparate. Cromatogramele au fost monitorizate la 260 nm cu detectorul PDA. Identificarea glucozei, fructozei, ramnozei, zaharozei şi acidului galacturonic în probele de suc de măr prin spectroscopia FT-MIR s-a realizat pe baza curbelor de calibrare elaborate la capitolul anterior. Datele primare obţinute au fost prelucrate cu ajutorul programelor IRsolution Software Overview (Shimadzu) şi Origin R 7SR1 Software (OriginLab Corporation, Northampton, USA). Pentru compararea diferitelor tipuri de enzime şi activităţi enzimatice între ele s-a utilizat testul 9

statistic ANOVA (One way ANOVA, Tukey Mean Comparison). În vederea determinării cantitative a glucozei, fructozei, zaharozei şi acidului galacturonic, ca principali compuşi eliberaţi în sucul de măr în urma hidrolizei substanţelor pectice, celuloze şi hemicelulozei, s-a utilizat programul Unscrambler X, versiunea 10.1 CAMO Software AS, aplicându-se atât metoda regresiei PLS cât şi cea a principalelor componente, PCA. REZULTATE ŞI DISCUŢII Spectrele FT-MIR şi regiunile de fingerprint specifice sucului de măr obţinut cu sau fără tratament enzymatic În figura 2.1 sunt redate spectrele FT-MIR integrale (4000 650 cm -1 ) (a) şi zonele de fingerprint (1200 900 cm -1 ) (b) ale sucurilor de măr obţinute cu şi fără (control) tratament enzimatic. Fig. 2.1. (a) Spectrele FT-MIR (4000 650 cm -1 ) ale sucului de măr obţinut cu şi fără (control) tratament enzimatic şi cele patru regiuni specifice identificate (I, II, III şi F); (b) Regiunile de fingerprint (F) (1200 900 cm -1 ) ale probelor din fig. 2.1.(a). Am selectat cele mai reprezentative probe obţinute Fig. 2.1. (a) The FT-MIR spectra (4000 650 cm -1 ) of apple juice obtained by enzymatic treatment and without enzimatic treatment (control) and the four specific regions indentified (I, II, III and F); (b) The fingerprint regions (F) (1200 900 cm -1 ) of the samples from fig. 2.1 (a). We selected the most specific samples after enzymatic treatment Spectrele FT-MIR ale sucurilor de măr, obţinute cu sau fără tratement enzimatic, prezintă cele patru zone de absorbţie ce apar în cazul spectrelor FT-MIR, cu mici modificări, şi anume: 3700-2800 cm -1 (I), 1800-1200 cm -1 (II), 1200-900 cm -1 (F) şi 900-750 cm -1 (III). Regiunea de fingerprint (F) în cazul sucului de măr este cea cuprinsă între 1200-900 cm -1. După cum se observă şi în figura 2.1 (a), zona de fingerprint (F) a glucidelor din sucul de mere este cuprinsă între 1200-900 cm -1, în cazul tuturor probelor. Apariţia acestei zone se datorează vibraţiilor date de legăturile C O şi C C, precum şi întinderilor simetrice date de legăturile dintre C O C (Dufour E., 2009). Aspectul acestei zone, în ceea ce priveşte forma, atât în cazul sucului de măr obţinut în urma unui tratament enzimatic cât şi a sucului obţinut fără un tratament enzimatic prealabil, este similar, modificându-se doar intensitatea peak-urilor. Peak-ul major ce apare în zona de fingerprint este cel din jurul frecvenţei de 1040 cm -1. După o normalizare a spectrului, în zona F se constată modificările formei spectrului induse de enzime. Astfel, în cazul probelor tratate cu enzime precum RPTE şi RDA6L se constată cele mai multe modificări faţă de control în timp ce enzima R10L nu induce modificări semnificative faţă de control. În figura 2.2 sunt redate atât spectrele FT-MIR integrale ale sucului de măr obţinute cu (RB1L3h24%, RCL3h24%) sau fără (control) tratament enzimatic (4000-650 cm -1 ) (a), cât şi regiunea de fingerprint a acestora (1200-900 cm -1 ) (b). 10

(a (b) Fig 2.2. (a). Spectrele FT-MIR (4000 650 cm -1 ) ale sucului de măr obţinut cu şi fără (control) tratament enzimatic şi cele trei regiuni specifice identificate (I, II şi F); (b) Regiunile de fingerprint (F) (1200 900 cm -1 ) ale probelor din fig. 2.2 (a). Am selectat cele mai reprezentative probe obţinute. Fig. 2.2 (a). The FT-MIR spectra (4000 650 cm -1 ) of apple juice obtained by enzymatic treatment and without enzimatic treatment (control) and the three specific regions indentified (I, II and F); (b) The fingerprint regions (F) (1200 700 cm -1 ) of the samples from fig. 2.2 (a). We selected the most specific samples after enzymatic treatment. Se observă că în zona de fingerprint (1200-900 cm -1 ) (F) apar unele diferenţe în ceea ce priveşte aspectul spectrelor la probele tratate cu celulaze, hemicelulaze, respectiv proba control (Fig. 2.2 (b)). Astfel, în cazul probelor tratate cu enzima RB1L se observă apariţia unui peak dominant în jurul frecvenţei de 1033 cm -1, peak caracterisic glucozei, şi a unui peak în jurul frecvenţei de 990 cm -1. Aspectul acestei zone din cadrul spectrelor FT-MIR a probelor tratate cu RB1L este asemănător cu spectrele obţinute în urma tratamentelor enzimatice efectuate cu pectinaze, lucru oarecum aşteptat deoarece acest preparat comercial conţine pe lângă activitatea hemicelulazică şi celulazică, şi activitate pectinazică. În cazul probelor tratate cu enzima RCL se observă că aspectul spectrelor este asemănător cu cel al probelor control. În cadrul acestor spectre se constată apariţia a 2 peak-uri dominante în jurul frecvenţelor de 1055, respectiv 1030 cm -1, peak-uri caracteristice zaharozei, respectiv glucozei. Alte peak-uri care mai apar în zona de fingerprint sunt cele din jurul frecvenţelor de 1016, 1060, 1080, 1105, 1149 cm -1, toate fiind caracteristice glucidelor din structura pulpei de măr. Studii de analiză cantitativă a principalilor produşi de hidroliză a enzimelor hidrolitice utilizând spectroscopia FT-MIR cuplată cu metode chemometrice Concentraţiile prezise pe baza modelelor de regresie PLS pentru glucidele din sucul de măr Concentraţiile principalilor produşi de hidroliză a substanţelor pectice, a celulozei şi hemicelulozei în sucul de măr obţinut în urma unui tratament enzimatic cu pectinaze, comparativ cu proba control (netratată enzimatic), au fost prezise pe baza modelelor de regresie PLS elaborate pentru fiecare compus, prezentate în detaliu în capitolul următor. În figura 2.3 sunt reprezentate grafic concentraţiile de carbohidraţi prezise prin regresie PLS, precum şi deviaţiile standard pentru fiecare probă analizată. 11

(a) Concentratia/Concentration (%) 12 10 8 6 4 2 0 Control RPL30min2.4% RPL30min12% RPL30min24% RPL3h2.4% RPL3h12% RPL3h24% RPL24h2.4% RPL24h12% RPL24h24% R10L30min2.4% R10L30min12% R10L30min24% R10L3h2.4% R10L3h12% R10L3h24% R10L24h2.4% R10L24h12% R10L24h24% Proba/Sample Glucoză Fructoză Zaharoză (b) 12 Concentratia/Concentration (%) 10 8 6 4 2 0 Glucoză Fructoză Zaharoză Control RPTE30min2.4% RPTE30min12% RPTE30min24% RPTE3h2.4% RPTE3h12% RPTE3h24% RPTE24h2.4% RPTE24h12% RPTE24h24% RDA6L30min2.4% Proba/Sample RDA6L30min12% RDA6L30min24% RDA6L3h2.4% RDA6L3h12% RDA6L3h24% RDA6L24h2.4% RDA6L24h12% RDA6L24h24% Fig. 2.3. Reprezentarea grafică a concentraţiilor prezise şi a deviaţiilor standard pentru glucoză, fructoză şi zaharoză în sucul de măr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RPL (a), R10L (a), RPTE (b) şi RDA6L (b), comparativ cu proba control (vezi cap. Materiale şi metode pentru coduri) Fig.2.3. Graphic representation of predicted concentrations and standard deviations for glucose, fructose and sucrose in apple juice obtained after enzymatic treatment with RPL (a), R10L (a), RPTE (b) and RDA6L (b), compared with control sample (see Materiale şi meode cap. for the codes) În cazul probelor tratate cu enzima RPL, cele mai mari concentraţii de glucoză (5,87%), fructoză (8,00%) şi zaharoză (6,78%) s-au obţinut în cazul tratării piureului cu o concentraţie de 12

24%, timp de 24 ore, concentraţii care sunt mult mai mari decât cele obţinute în cazul probei control (2,10% glucoză, 4,72% fructoză, 1,43% zaharoză). Atât în cazul enzimei R10L, cât şi în cazul enzimei RDA6L, cele mai bune rezultate în ceea ce privesc concentraţiile de glucoză, fructoză şi zaharoză s-au obţinut după un timp de incubare de 24 ore şi o concentraţie a enzimei raportată la substrat de 24%. În comparţie cu primele trei enzime amintite mai sus, enzima RPTE prezintă cea mai bună viteză de reacţie pe acest substrat (30 min) însă specificitatea enzimei este destul de redusă (concentraţia necesară pentru o activitate optimă e de 24%). Cu toate că prezintă o viteză de reacţie superioară celorlalte preparate, randamentul enzimei RPTE este mai scăzut comparativ cu cel al enzimei R10L, eliberând o cantitate maximă de glucoză de 6,73%, de 9,18%, fructoză iar cea de zaharoză fiind de 7,92% (Fig. 2.3 (b)). Principalii produşi de hidroliză ai substanţelor pectice sub acţiunea pectinazelor sunt acidul galacturonic şi ramnoza. Toate concentraţiile acestor compuşi în probele tratate enzimatic sunt mai mari, comparativ cu proba control (ramnoză 2,89%, acid galacturonic 7,12%) (Fig. 2.4 (a) şi (b)). 20 Concentratia/Concentration (%) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 C ontrol R P L 30min2.4% R P L30min12% R P L30min24% R P L3h2.4% R P L3h12% R P L3h24% R PL 24h2.4% R P L 24h12% R P L 24h24% R 10L 30min2.4% R 10L30min12% R 10L30min24% R 10L3h2.4% R 10L3h12% R 10L3h24% R 10L 24h2.4% R 10L 24h12% R 10L 24h24% Proba/Sample Ramnoză Acid galacturonic 13

Concentratia/Concentration (%) 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 C ontrol RPTE30min2.4% RPTE30min12% RPTE30min24% RPTE3h2.4% RPTE3h12% RPTE3h24% RPTE24h2.4% RPTE24h12% RPTE24h24% RDA6L30min2.4% Proba/Sample RDA6L30min12% RDA6L30min24% RDA6L3h2.4% RDA6L3h12% RDA6L3h24% RDA6L24h2.4% RDA6L24h12% RDA6L24h24% Ramnoză Acid galacturonic Fig. 2.4. Reprezentarea grafică a concentraţiilor prezise şi a deviaţiilor standard pentru ramnoză şi acidul galacturonic în sucul de măr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RPL (a), R10L (a), RPTE (b) şi RDA6L (b), comparativ cu proba control (vezi cap. Materiale şi metode pentru coduri) Fig. 2.4. Graphic representation of predicted concentrations and standard deviations for rhamnose and galacturonic acid in apple juice obtained after enzymatic treatment with RPL (a), R10L (a), RPTE (b) and RDA6L (b), compared with control sample (see Materiale şi meode cap. for the codes) În cazul probelor de măr tratate cu enzima RPL, concentraţia maximă de ramnoză (7,53%) s-a obţinut în urma unui timp de incubare de 24 ore şi cu o concentraţie enzimatică de 24% (Fig. 2.4 (a)), în timp ce concentraţia maximă de acid galacturonic (17,71%) s-a obţinut în cazul probelor tratate cu o concentraţie de 2,4%, timp de 3 ore (Fig. 2.4 (a)). Pentru enzimele R10L şi RPTE optimul activităţii enzimatice, determinat prin eliberarea ramnozei şi acidului galacturonic s-a atins după 24 de ore de incubare, la o concentraţie de 24% enzimă în cazul enzimei R10L, respectiv 12% în cazul enzimei RPTE. Concentraţia maximă de ramnoză a fost de 9,85% pentru enzima R10L şi de 8,23% pentru enzima RPTE, iar concentraţia maximă de acid galacturonic a fost de 18,13% pentru R10L, respectiv 17,88% pentru RPTE (Fig. 2.4 (a) şi (b)). În cazul enzimei RDA6L concentraţiile maxime obţinute au fost de 9,03% ramnoză şi 18,22% acid galacturonic (Fig. 2.4 (b)). Aceste concentraţii au fost obţinute după 24 de ore de incubare cu o concentraţie de 24% enzimă, respectiv după 3 ore de incubare la o concentraţie de 2,4%. Concentraţiile de glucoză, fructoză şi zaharoză prezise prin regresie PLS în cazul probelor tratate cu celulaze şi hemicelulaze, comparativ cu proba control sunt redate grafic în figura 2.5. 14

C oncentratia/c oncentration (%) 14 12 10 8 6 4 2 0 C ontrol RB1L30min24% RB1L30min12% RB1L30min2.4% RB1L3h24% RB1L3h12% RB1L3h2.4% RB1L24h24% RB1L24h12% RB1L24h2.4% RC L30min24% RC L30min12% RC L30min2.4% Proba/Sample RC L3h24% RC L3h12% RC L3h2.4% RC L24h24% RC L24h12% RC L24h2.4% Glucoză Fructoză Zaharoză Fig. 2.5. Reprezentarea grafică a concentraţiilor prezise şi a deviaţiilor standard pentru glucoză, fructoză şi zaharoză în sucul de măr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RB1L şi RCL, comparativ cu proba control (vezi cap. Materiale şi metode pentru coduri) Fig. 2.5. Graphic representation of predicted concentrations and standard deviations for glucose, fructose and sucrose in apple juice obtained after enzymatic treatment with RB1L and RCL, compared with control sample (see Materiale şi meode cap. for the codes) După cum era şi de aşteptat, în urma activităţii enzimatice a preparatului RB1L asupra substartului de măr se constată că, concentraţiile de glucoză, fructoză şi zaharoză cresc, dar nu la fel de mult ca şi în cazul probelor tratate cu enzima RCL, acest lucru explicându-se prin faptul că enzima RCL are activitate principală celulazică, în timp ce enzima RB1L are activitate principală pectinazică şi hemicelulazică. Spre deosebire de enzima RB1L, sub acţiunea enzimei RCL s-au eliberat concentraţii mai mari de glucide, 7,23% glucoză, 11,42% fructoză, în timp ce în cazul zaharozei concentraţiile prezise au fost mai mici (4,46%) (Fig. 2.5). Figura 2.6 reprezintă grafic concentraţiile de ramnoză şi acid galacturonic prezise în sucul de măr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RB1L şi RCL, comparativ cu proba control. 15

C oncenmtratia/c oncentration (%) 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 C ontrol RB1L30min24% RB1L30min12% RB1L30min2.4 RB1L3h24% RB1L3h12% RB1L3h2.4% RB1L24h24% RB1L24h12% RB1L24h2.4% RC L30min24% RC L30min12% RC L30min2.4% RC L3h24% RC L3h12% RC L3h2.4% RC L24h24% RC L24h12% RC L24h2.4% Proba/Sample Ramnoză Acid galacturonic Fig. 2.6. Reprezentarea grafică a concentraţiilor prezise şi a deviaţiilor standard pentru ramnoză şi acidul galacturonic în sucul de măr obţinut în urma unor tratamente enzimatice cu RB1L şi RCL comparativ cu proba control (vezi cap. Materiale şi metode pentru coduri) Fig. 2.6. Graphic representation of predicted concentrations and standard deviations for rhamnose and galacturonic acid in apple juice obtained after enzymatic treatment with RB1L and RCL compared with control sample (see Materiale şi metode cap. for the codes) În ceea ce privesc concentraţiile de ramnoză şi acid galacturonic, principalii produşi de hidroliză ai substaţelor pectice, în cazul enzimei RB1L au fost prezise cele mai mari concentraţii, lucru explicat prin activitatea pectinazică a preparatului. Spre deosebire de enzima RB1L, pentru probele tratate cu enzima RCL valorile concentraţiilor prezise de ramnoză şi acid galacturonic au fost mai scăzute: 4,63%, respectiv 14,22%. Studii de analiză cantitativă, prin cromatografie HPLC, a principalilor produşi rezultaţi prin hidroliză enzimatică În scopul validării metodei spectroscopice FT-MIR şi a metodei de prezicere a concentraţiei prin regresie PLS, ca metode adecvate determinării concentraţiilor diferiţilor glucide/compuşi în anumite probe, au fost determinate concentraţiile de glucoză, fructoză, ramnoză, zaharoză şi acid galacturonic şi prin metoda HPLC. În figura 2.7 este prezentată o cromatogramă reprezentativă a probelor tratate cu enzimele mai sus amintite. 16

Fig. 2.7. O cromatogramă reprezentativă ce evidenţiază separarea glucidelor în sucul de măr rezultat după tratatament enzimatic Fig. 2.7. A representative chromatogram of the separation of carbohydrates from apple juice obtained after enzymatic treatment În urma elaborării standardelor de glucoză şi acid galacturonic, s-a constat că aceşti doi compuşi au acelaşi timp de retenţie, ceea ce înseamnă că într-un amestec care conţine ambii compuşi, aceştia nu se separă, apărând un singur peak caracteristic (vezi cromatogramă în capitolul următor). Astfel, concentraţiile de glucoză şi acid galacturonic determinate prin HPLC în probele de suc de măr au fost calculate împreună, pe baza ariei aceluiaşi peak (Fig. 2.7). În tabelul 2.1 sunt redate concentraţiile de carbohidraţi obţinute atât prin regresie PLS cât şi prin HPLC. Tabel 4.4 Valori prezise şi determinate prin HPLC pentru glucoză şi acig galacturonic, fructoză, ramnoză şi zaharoză în zece sucuri de măr obţinute prin tratament enzimatic şi o probă control Table 4.4 Predicted and HPLC determined concentrations of glucose and glacturonic acid, fructose, rhamnose and sucrose in ten apple juices obtained after enzymatic treatment and an control sample Proba Sample Glucoză şi ac. gal. Glucose and gal. ac. Prezisă Predicted (%) HPLC (%) Prezisă Predicted (%) Fructoză Fructose HPLC (%) Ramnoză Rhamnose Prezisă Predicted (%) HPLC (%) Prezisă Predicted (%) Zaharoză Sucrose Control 9,15 9,20 4,84 4,81 2,65 2,33 1,51 1,32 RPL24h24% 23,51 23,66 8,00 8,12 7,53 7,54 6,78 6,73 RPL24h2,4% 19,80 19,77 4,73 4,80 2,85 2,77 1,89 1,90 R10L24h24% 25,84 25,90 10,62 10,54 9,85 9,99 8,49 8,51 R10L30min24% 20,29 20,32 4,81 4,76 3,34 3,38 3,03 3,06 RPTE30min24% 24,57 24,47 9,18 9,22 7,24 7,22 7,92 8,00 RPTE30min2,4% 22,33 22,37 4,98 5,01 3,61 3,67 5,45 5,57 RB1L3h24% 22,54 22,51 9,42 9,47 7,77 7,79 6,84 6,75 RB1L24h24% 14,90 14,83 4,92 4,96 4,57 4,66 3,81 3,93 HPLC (%) 17

Continuare Tabel 2.1 Proba Sample Glucoză şi ac. gal. Glucose and gal. ac. Prezisă Predicted (%) HPLC (%) Prezisă Predicted (%) Fructoză Fructose HPLC (%) Ramnoză Rhamnose Prezisă Predicted (%) HPLC (%) Prezisă Predicted (%) Zaharoză Sucrose RCL30min24% 20,99 20,90 11,42 11,39 4,47 4,51 4,15 4,19 RCL24h24% 20,26 20,20 10,52 10,61 4,09 4,11 3,84 3,80 HPLC (%) Astfel, se observă că, concentraţiile determinate prin HPLC sunt aproximativ egale cu cele prezise prin spectroscopie FT-MIR şi regresie PLS, existând unele diferenţe, însă aceste nu sunt semnificative. Studii de analiză calitativă prin metoda principalelor componente (PCA) În scopul evidenţierii unor diferenţe calitative între probele de suc de măr obţinute în urma tratamentelor enzimatice cu celulaze, hemicelulaze şi pectinaze, datele obţinute prin înregistrarea spectrelor FT-MIR au fost normalizate iar apoi prelucrate prin metoda chemometrică a principalelor componente (PCA). În urma analizării rezultatelor obţinute prin prelucrarea probelor tratate cu cele patru tipuri de pectinaze, după cum se observă şi în figura 2.8, se poate afirma faptul că, comparativ cu probele de sfeclă de zahăr tratate cu aceleaşi preparate enzimatice, în acest caz nu s-a obţinut o grupare satisfăcătoare a probelor în funcţie de tratamentul aplicat. Fig. 2.8. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale, PC1 şi PC2, obţinute din analiza PCA a sucurilor de măr tratate cu cele patru tipuri de pectinaze (RPL, R10L, RPTE şi RDA6L) Fig. 2.8. Score plots of the first two principal components, PC1 and PC2, obtained from the PCA of the apple juices treated with the four types of enzymes (RPL, R10L, RPTE and RDA6L) 18

Chiar dacă nu s-a obţinut o discriminare satisfăcătoare, cele mai bune rezultate au fost obţinute prelucrând datele FT-MIR pe intervalul 1200-900 cm -1. Astfel, în figura 2.8 se observă că în acest caz primele două componente explică un total de 92% din varianta totală, din care PC1 explică 82%, în timp ce PC2 explică doar 10% din varianţă. În cazul probelor tratate cu celulaze şi hemicelulaze, se poate constată că acestea se grupează mult mai bine decât cele tratate cu pectinaze, distingându-se două grupe distincte, în funcţie de tratamentul enzimatic aplicat (Fig. 2.9). Fig. 2.9. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale, PC1 şi PC2, obţinute din analiza PCA a sucurilor de măr tratate cu cele două tipuri de celulaze şi hemicelulaze (RB1L şi RCL) Fig. 2.9. Score plots of the first two principal components, PC1 and PC2, obtained from the PCA of the apple juices treated with the two types of enzymes (RB1L and RCL) Se constată că şi în acest caz cele mai bune rezultate s-au obţinut în cazul prelucrării probelor pe domeniul 1200-900 cm -1 şi primele două componente principale sunt cele care explică cel mai mult din varianţa totală. PC1 explică şi în acest caz cel mai mult din varianţa totală, 96%, în timp ce PC2 explică doar 3% din varianţă, împreună cele două componente explicând 99% din varianţa totală (Fig. 2.9). Se mai poate observa faptul că cele două grupe separate sunt distribuite de-a lungul axei PC1, confirmând faptul că prima componentă principală are cel mai important rol în separarea probelor tratate cu celulaze şi hemicelulaze. Frecvenţele care joacă rolul cel mai important în gruparea probelor de-a lungul axe PC1 sunt cele caracteristice în special glucozei, şi anume, 1033, 999 şi 1100 cm -1. În figura 2.10 se observă separarea probelor de suc de măr în funcţie de tratamentul enzimatic aplicat iniţial piureului de măr. 19

Fig. 2.10. Distribuţia scorurilor pentru primele două componente principale, PC1 şi PC2, obţinute din analiza PCA a sucurilor de măr tratat cu celulaze, hemicelulaze (CHC) şi pectinaze (P) Fig. 2.10. Score plots of the first two principal components, PC1 and PC2, obtained from the PCA of the apple juices treated with cellulases, hemicelulases (CHC) and pectinases (P) Se observă că, dacă se compară din punct de vedere calitativ probele tratate cu celulaze şi hemicelulaze (CHC) cu probele tratate cu pectinaze (P), acestea se separă distinct în două grupe corespunzătoare tratamentului enzimatic. Astfel, se constată din nou că primele două componete joacă rolul cel mai important în separarea probelor, PC1 explicând cel mai mult din varianţa totală, 89%, iar PC2 explicând doar 6%, totalul fiind de 95% varianţă totală explicată. De asemenea, se observă că probele tratate cu pectinaze se separă mai ales de-a lungul axei PC1, în schimb probele tratate cu celulaze şi hemicelulaze se separă atât de-a lungul axei PC1, caât şi dea lungul axei PC2 (Fig. 2.10). Deci, se poate spune că s-a obţinut o grupare a probelor hidrolizate în funcţie de tratamentul enzimatic aplicat pe substrat de piure de măr. Metoda principalelor componente poate fi astfel utilizată în vederea discriminării diferitelor tipuri de probe tratate cu diverse tipuri de enzime hidrolitice. 3. STUDII COMPARATIVE DE HIDROLIZĂ ENZIMATICĂ PE SUBSTRAT DE SFECLĂ DE ZAHĂR (BETA VULGARIS) MATERIALE ŞI METODE Au fost utilizate aceleaşi tipuri de enzime descrise la studiu pe măr. ph-urile optime de acţiune al acestor enzime au fost asigurate de tamponul acetat cu ph de 3,9, în cazul enzimelor RPL, R10L, RPTE, RDA6L şi de 4,4 în cazul enzimelor RB1L şi RCL. 20

Sfecla de zahăr utilizată în acest studiu provine de la Fabrica de Zahăr S.C. Zahărul Luduş, judeţul Mureş, partea utilizată fiind reprezentată de rădăcina (pulpa) sfeclei de zahăr, aceasta fiind păstrată la -20 C până în momentul prelucrării. Prepararea probelor, tratamentul enzimatic, analizele FT-MIR, HPLC şi cele statistice au fost aceleaşi ca în cazul substratului de măr. REZULTATE ŞI DISCUŢII Spectrele FT-MIR şi regiunile de fingerprint specifice sucului de sfeclă de zahăr obţinut cu sau fără tratament enzimatic a) Tratamente enzimatice efectuate cu RPL În figura 3.1 sunt redate spectrele FT-MIR integrale (a) şi regiunile de fingerprint specifice (b) sucului de sfeclă de zahăr obţinut în urma unui tratament enzimatic cu enzima RPL, precum şi a sucurilor de sfeclă de zahăr obţinut fără tratament enzimatic. (a) (b) Fig. 3.1. (a) Spectrele FT-MIR (4000-650 cm -1 ) ale sucului de sfeclă de zahăr obţinut după un tratament enzimatic cu RPL, precum şi a sucului de sfeclă de zahăr obţinut fără tratament enzimatic (control) şi cele patru regiuni specifice identificate (I, II, F şi III); (b) Regiunile de fingerprint (F) (1200-900 cm -1 ) ale probelor din fig. 3.1 (a). Am selectat cele mai reprezentative probe obţinute Fig. 3.1. (a) The FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained after an enzymatic treatment with RPL, as well as, the FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained without enzimatic treatment (control) and the four specific regions indentified (I, II, F and III); (b) The fingerprint regions (F) (1200-900 cm -1 ) of the samples from fig. 3.1 (a). We selected the most specific samples after enzymatic treatment Se poate observa că nu apar modificări majore în ceea ce priveşte forma celor patru regiuni din cadrul spectrelor FT-MIR la probele tratate cu enzima RPL, comparativ cu proba control. Peak-urile care apar în regiunea 1800-1200 cm -1 (II) sunt cele din jurul frecvenţelor de 1637, 1558, 1411, 1337 şi 1271 cm -1, această regiune fiind una caracteristică în general substanţelor polizaharidice din pulpa sfeclei de zahăr (Wellner N. şi col., 1998). În regiunea de fingerprint (1200-900 cm -1 ) (Fig. 3.1 (b)) apar peak-urile caracteristice diferiţilor carbohidraţi, şi anume: 1107, 1045, 991 şi 923 cm -1. Analizându-se aceaste regiuni s-a constatat că singura diferenţă care apare în spectrele FT-MIR ale sucului de sfeclă de zahăr este aceea că în cazul probei control apare un peak în jurul frecvenţei de 1130 cm -1, peak care dispare la probele tratate enzimatic, cu excepţia probei tratate cu o concentraţie de enzimă de 2,4% şi incubată timp de 24 ore. Se mai schimbă, de asemenea, raportul dintre principalele peak-uri ce apar în acestă zonă, şi anume raportul 1045/991 cm -1. 21

b) Tratamente enzimatice efectuate cu R10L La fel ca şi în cazul probelor tratate cu enzima RPL, şi în cazul probelor tratate cu enzima R10L, se constată că spectrele FT-MIR ale sucurilor de sfeclă de zahăr obţinute în urma unui tratament enzimatic sunt foarte bine definite (Fig. 3.2 (a) şi (b)). (a) (b) Fig. 3.2. (a) Spectrele FT-MIR (4000-650 cm -1 ) ale sucului de sfeclă de zahăr obţinut după un tratament enzimatic cu R10L şi a sucului de sfeclă de zahăr obţinut fără tratament enzimatic (control) şi cele patru regiuni specifice identificate (I, II, F şi III); (b) Regiunile de fingerprint (F) (1200-900 cm -1 ) ale probelor din fig. 3.2 (a). Am selectat cele mai reprezentative probe obţinute Fig. 3.2. (a) The FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained after an enzymatic treatment with R10L and the FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained without enzimatic treatment (control) and the four specific regions indentified (I, II, F and III); (b) The fingerprint regions (F) (1200-900 cm -1 ) of the samples from fig. 3.2 (a). We selected the most specific samples after enzymatic treatment Spre deosebire de proba control şi de probele tratate cu enzima RPL, regiunea II a probelor tratate cu enzima R10L este uşor diferită. Dacă în cazul probelor tratate cu enzima RPL şi control, peak-ul ce apare în jurul frecvenţei de 1558 cm -1 este bine reprezentat, în cazul majorităţii probelor tratate cu enzima R10L acest peak este foarte slab reprezentat (Fig. 3.2 (a)). De asemenea, se constată că dispariţia acestui peak în cazul probelor tratate cu R10L este corelată cu apariţia peak-ului din jurul frecvenţei de 1030 cm -1, din regiunea de fingerprint (Fig. 3.2 (a) şi (b)). În cazul regiunii de fingerprint (1200-900 cm -1 ), spectrele FT-MIR se modifică la unele dintre probele tratate cu enzima R10L, comparativ cu proba control şi cu probele tratate cu enzima RPL. Dacă în cazul probei control, peak-urile din regiunea F apar la aceleaşi frecvenţe ca şi în cazul probelor tratate cu enzima RPL (1130, 1107, 1045, 991 şi 923 cm -1 ), în cazul probelor tratate cu enzima R10L apar unele modificări, cum ar fi dispariţia peak-urile de la frecvenţele 1130 şi 1045 cm -1 şi apariţia unui peak dominant în jurul frecvenţei 1030 cm -1 (caracteristic glucozei). Excepţie fac doar probele tratate cu o concentraţie de 2,4, 24 şi 12% enzimă şi incubate timp de 30 min şi 3 ore. c) Tratamente enzimatice efectuate cu RPTE În figura 3.3 sunt redate spectrele FT-MIR ale sucurilor de sfeclă de zahăr obţinute în urma unui tratament enzimatic cu preparatul RPTE (a), precum şi regiunea de fingerprint a acestora (1200-900 cm -1 ) (b). 22

(a) (b) Fig. 3.3. (a) Spectrele FT-MIR (4000-650 cm -1 ) ale sucului de sfeclă de zahăr obţinut după un tratament enzimatic cu RPTE şi a sucului de sfeclă de zahăr obţinut fără tratament enzimatic (control) şi cele patru regiuni specifice identificate (I, II, F şi III); (b) Regiunile de fingerprint (F) (1200-900 cm -1 ) ale probelor din fig. 3.3 (a). Am selectat cele mai reprezentative probe obţinute Fig. 3.3. (a) The FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained after an enzymatic treatment with RPTE and the FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained without enzimatic treatment (control) and the four specific regions indentified (I, II, F and III); (b) The fingerprint regions (F) (1200-900 cm -1 ) of the samples from fig. 3.3 (a). We selected the most specific samples after enzymatic treatment Şi în cazul celor patru regiuni identificate în spectrele FT-MIR ale sucului de sfeclă de zahăr obţinut în urma unui tratament prealabil a pulpei cu enzima RPTE sunt aproape identice cu cele ale probei control (Fig. 3.3 (a)). Diferenţa dintre pobele tratate cu acest preparat enzimatic şi proba control apare în regiunea de fingerprint (1200-900 cm -1 ) şi se referă la raportul dintre principalele peak-uri ce apar în această regiune: 1045 şi 991 cm -1. Dacă în cazul probei control, peak-ul 991 cm -1 este peak-ul dominant, în cazul majorităţii probelor tratate cu enzima RPTE, peak-ul dominat devine cel din jurul frecvenţei 1045 cm -1. În ceea ce priveşte regiunea 900-700 cm -1, nu apar diferenţe semnificative faţă de proba control. d) Tratamente enzimatice efectuate cu RDA6L În figura 3.4 sunt redate atât regiunile de fingerprint (1200-900 cm -1 ) (F) (b), cât şi celelalte regiuni caracteristice sucului de sfeclă de zahăr (I, II, III) (a) obţinut prin tratarea piureului de sfeclă cu enzima Rohapect DA6L, comparativ cu proba control. (a) (b) Fig. 3.4. (a) Spectrele FT-MIR (4000-650 cm -1 ) ale sucului de sfeclă de zahăr obţinut după un tratament enzimatic cu RDA6L şi a sucului de sfeclă de zahăr obţinut fără tratament enzimatic (control) şi cele patru regiuni specifice identificate (I, II, F şi III); (b) Regiunile de fingerprint (F) (1200-900 cm -1 ) ale probelor din fig. 3.4 (a). Am selectat cele mai reprezentative probe obţinute Fig. 3.4. (a) The FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained after an enzymatic treatment with RDA6L and the FT-MIR spectra (4000-650 cm -1 ) of sugar beet juice obtained without enzimatic treatment (control) 23