Raport ştiinţific Grant TD 282/2008 cu tema AMINELE BIOGENE-IMPLICATII IN PATOLOGIA UMANA Director grant Asist.drd.Zamosteanu Nina ANUL 2008 Rezultatele obţinute pe parcursul anului 2008 au avut ca obiectiv validarea metodei - HPLC de dozare a unor amine biogene : histamina, cadaverina, tiramina, putresceina. Metoda de validare şi procedura de analiză a produselor alimentare s-a realizat în conformitate cu ghidurile de validare pentru metodele analitice ale FDA (Food and Drug Administration, SUA); EMEA (European Agency for the Evaluation of of Medicinal Products on Evaluation of Medicines for Human Use) şi Procedurile Standard de Operare ale Laboratorului de Bioechivalenţă al Fabricii de Antibiotice Iaşi. 1. Aspecte teoretice ale determinării continutului in amine biogene 1.1. Obiectiv Obiectivul acestui protocol este de a furniza procedura de validare a metodei HPLC utilizatǎ pentru determinarea conţinutului în amine biogene (histamină, tiramină, cadaverină si putresceina) şi de a demonstra că metoda satisface cerinţele de: liniaritate şi precizie, acurateţe, precizie intermediarǎ şi reproductibilitate, limitǎ de detecţie şi cuantificare, selectivitate. 1.2. Scopul validării Scopul validării este de a aplica protocolul de validare al metodei HPLC de determinare a conţinutului în histamină, tiramină, cadaverină si putresceină din produse alimentare: vin şi salam. 1.3. Metoda analitica Condiţii de operare Coloană cromatografică Lichrosorb (sau echivalentă) RP 18 (250mm x 4,6 mm. i.d.) (5μm); fază mobilă A: un amestec format din 0,1 ml trietilamină şi 800 ml acetat de sodiu 0,02M corectat la ph 7,2 cu acid acetic 2% la care se adaugă 3 ml tetrahidrofuran şi se aduce la 1000 ml cu apă distilată; fază mobilă B: acetat de sodium 0,1M ( corectat la ph 7,2 cu acid acetic 2%) acetonitril metanol: 200:400:400 (v/v/v); detector UV, λ= 338 nm; debitul fazei mobile: 0,9 ml/min; volum injectat 20 μl; soluţie ortoftaldialdehidă: amestec de 100 mg ortoftaldialdehidă, 10 ml soluţie acid boric (2,47g Soluţii utilizate Soluţia de referinţă: se dizolvă 5,0 mg histamină, 5,0 mg tiramină, 5,0 mg cadaverină si 5,0 mg putresceina în 10 ml acid tricloracetic; Soluţia de analizat: la 1 ml probă se adaugă 0,2 ml ortoftaldialdehidă şi se aduce la 2,5 ml cu metanol; Reacţie de culoare: la 1 ml soluţie de analizat respectiv 1 ml soluţie referinţă se adaugă 0,5 ml metanol, 0,1 ml ortoftaldialdehidă şi se diluează la 2,5 ml cu metanol;
acid boric cu 75 ml apă distilată corectat la ph 10,4 cu hidroxid de potasiu 45%), 0,03 ml mercaptoetanol şi 0,1 ml metanol.(lange, 2002) 1.4 Definirea parametrilor statistici Parametrii statistici utilizaţi în validare sunt: a) liniaritate şi domeniul de liniaritate b) precizie c) acurateţe d) limitǎ de detecţie şi cuantificare e) precizie intermediarǎ şi reproductibilitate f) selectivitate a)liniaritate şi domeniu de liniaritate Se verifică liniaritatea răspunsului (arie) în domeniul de concentraţie impus de metoda de lucru pentru histamină, tiramină şi cadaverină. Pentru a stabili dacă între cele două seturi de date obţinute există o dependenţă liniară, s-a calculat coeficientul de corelaţie. Pentru determinarea ecuaţiei dreptei de calibrare şi a coeficientului de corelaţie s- a utilizat Microsoft Excel. Domeniu de liniaritate: este intervalul cuprins între limita de detecţie şi nivelul maxim de concentraţie studiat al liniaritǎţii. Criterii de acceptanţǎ: valoarea coeficientului de corelaţie trebuie sǎ fie situat în intervalul 0,990 1, cea ce demonstreazǎ cǎ, în intervalul studiat, dependenţa între concentraţie şi răspuns este liniară. b) Precizie Pentru confirmarea preciziei, metoda s-a aplicat pe un număr de 5 înregistrări replicate efectuate pentru fiecare nivel de concentraţie de la studiul liniaritǎţii, calculându-se pentru fiecare concentraţie valoarea deviaţiei standard relativǎ (RSD) şi repetabilitatea (R) cu formulele: STD 100 RSD% = y în care: STD = deviaţia standard a valorilor lui y; RSD = deviaţie standard relativǎ; y = media aritmetică a valorilor lui y. R % = 2 2 RSD% Criterii de acceptanţǎ: deviaţia standard relativǎ (RSD) pentru fiecare nivel de concentraţie trebuie sǎ se situeze sub 1%, pentru ca metoda propusă sǎ asigure precizia necesară unei determinări analitice. c) Acurateţe Acurateţea reprezintă gradul în care rezultatele generate prin aplicarea metodei de dozare a histaminei, tiraminei şi cadaverinei se situează mai aproape de valorile teoretice.
Acurateţea se exprimǎ prin abaterea (%) valorilor experimentale faţǎ de cele teoretice. Acurateţea este mǎsura exactitǎţii metodei analitice. Se determinǎ conţinutul în histamină, tiramină, cadaverină si putresceina, conform metodei, pe trei probe preparate sintetic, ce conţin 400 μg/ml, 500 μg/ml respectiv 600 μg/ml histamină, tiramină, cadaverină si putresceina în cantitǎţi echivalente cu trei nivele de concentratie: 80%, 100% respectiv 120% faţă de cantitatea teoretică. Se determinǎ pentru fiecare nivel de concentraţie: media, deviaţia standard şi deviaţia standard relativǎ (RSD) a conţinuturilor în histamină, tiramină şi cadaverină. Se calculeazǎ abaterea valorilor practice medii faţǎ de cele teoretice. Criterii de acceptanţǎ: abaterea relativǎ (%) trebuie să fie sub 1% d) Limitǎ de detecţie şi cuantificare Limita de detecţie (LOD) reprezintă cea mai mică concentraţie care poate fi considerată ca semnal dat de substanţa examinată. LOD = y 0 + 3STD S în care: y 0 este interceptul cu ordonata al dreptei de calibrare; STD = variaţia standard a valorilor ariilor pentru concentraţie cea mai scăzută; S = panta dreptei de calibrare arie/concentraţie. Limita de cuantificare (LOQ) reprezintă cea mai mică concentraţie de produs care poate fi cantitativ evaluat cu aceeaşi precizie şi acurateţe ca a metodei analitice. LOQ = y 0 + 10STD S în care semnificaţia mărimilor utilizate este aceeaşi cu cea data mai sus. În unele cazuri, LOD poate avea aceeaşi valoare ca şi LOQ. e)precizie intermediarǎ şi reproductibilitate Se realizeazǎ determinǎri replicate pe acelaşi analit, în aceleaşi condiţii impuse de metodă, de acelaşi analist, în zile diferite şi se calculeazǎ pentru fiecare determinare: media, deviaţia standard, deviatia standard relativǎ (RSD) pentru conţinut în histamină şi timp de retenţie. Criterii de acceptanţǎ: RSD (%) pentru conţinut trebuie să fie sub 1% iar pentru timp de retenţie sub 2%. f) Selectivitea Este parametrul de validare prin care se demonstreazǎ cǎ în metoda prezentatǎ histamina nu co-elueazǎ cu alţi componenţi datoraţi solventului sau altor compuşi prezenţi în probă. Selectivitatea metodei este evaluatǎ prin :
- injectarea unei soluţii martor (solvent) Criterii de acceptanţǎ: -lipsa interferenţelor datorate solventului sau altor compuşi prezenţi în probă, în raport cu timpul de retenţie al histaminei. 2. Rezultate obţinute Au fost eluate pe cromatograf soluţiile ce conţin etaloanele derivatizate de histamină, tiramină, cadaverină si putresceină. Pe baza datelor obtinuţe au fost trasate curbele etalon pentru cele patru amine, şi au fost evaluati parametrii validării, prezentaţi in tabelul I. Parametrii statistici utilizaţi în validarea metodei sunt: liniaritate şi domeniul de liniaritate, precizie, acurateţe, limitǎ de detecţie şi cuantificare, precizie intermediarǎ şi reproductibilitate, selectivitate. Liniaritatea metodei Intervalul de liniaritate a fost studiat prin efectuarea de determinări pentru concentraţii de histamina, tiramina, cadaverina si putresceina cuprinse intre 10 µg/ml si 600 µg/ml. In continuare sunt prezentate rezultatele obtinute si prelucrarea statistica ( tab.i ) pentru aminele studiate. TABELUL I Date utilizate pentru trasarea curbei de etalonare a aminelor studiate Histamina Concentraţie μg / ml Arie medie 10 4520 25 4300 50 9000 100 18200 200 36522 500 92027 600 118470 10 9862 Coeficient de corelaţie, r Domeniu de liniaritate μg/ml Ecuatia dreptei de regresie 0,9966 25 600 y=190.3489x-327.07 Tiramina Cadaverina 25 8231 50 12341 100 32651 200 74534 500 197439 600 237535 10 4633 25 3122 50 5892 100 11765 200 23988 500 69650 600 83888 0,9978 25 600 y=399.158x-2786.99 0,9946 25 600 y=137,835x-634,258
Putresceina 10 5678 0,9601 25 600 Y=297,416x-2035,67 25 9454 50 12546 100 23768 200 65432 500 143245 600 196543 Precizia metodei Pentru confirmarea preciziei, metoda s-a aplicat pe un număr de 5 înregistrări replicate efectuate pentru fiecare nivel de concentraţie de la studiul liniaritǎţii, calculându-se pentru fiecare concentraţie valoarea deviaţiei standard relativǎ (RSD) şi repetabilitatea (R). Rezultatele sunt redate in tabelul II.. TABELUL II Valori obţinute pentru precizia metodei Compus analizat Parametru statistic Valoare Deviatie standard a 46,48 Histamina valorilor ariilor medie (STD) Deviatie standard relativa 0,44% medie ( RSD%) Repetabilitate medie(r%) 1,25% Deviatie standard a 1273,49 Tiramina valorilor ariilor medie (STD) Deviatie standard relativa 1,61% medie ( RSD%) Repetabilitate medie(r%) 4,45% Deviatie standard a 345,67 Cadaverina valorilor ariilor medie (STD) Deviatie standard relativa 1,14% medie ( RSD%) Repetabilitate medie(r%) 3,95% Valorile obţinute pentru deviaţia standard relativǎ (RSD) sunt situate sub 5%, ceea ce conferǎ precizie metodei analitice. Limitǎ de detecţie şi cuantificare Calculul limitelor de detecţie şi cuantificare pentru aminele studiate, s-a realizat in conformitate cu ghidurile de validare. Pentru histamina s-au obtinut urmatoarele valori: Limită de detecţie (LOD): 2,9341 μg/ml Limită de cuantificare (LOQ): 5,7711 μg/ml Pentru tiramină s-au obţinut urmǎtoarele valori:
Limită de detecţie(lod):7,56μg/ml Limită de cuantificare(loq): 8,92 μg/ml Pentru cadaverină s-au obţinut urmǎtoarele valori: Limită de detecţie (LOD): 8,13μg/ml Limită de cuantificare (LOQ): 16,15μg/ml. Acurateţea metodei Acurateţea a fost apreciată prin calcularea erorii relative a regăsirii in intervalul de concentraţii cuprins intre 400-600 μg/ml pentru aminele studiate. Deoarece valorile obţinute pentru eroarea relativǎ sunt situate sub 1%, metoda utilizată prezintă acurateţea unei metode analitice. Selectivitate În cromatograma obţinută cu solutia martor (solvent) (fig.1) nu se înregistreazǎ picuri care sǎ interfere cromatograma obţinută cu soluţia de analizat (fig2), ceea ce demonstreazǎ ca solventul nu interferă analiza. A fost apoi eluat amestecul de amine. Cromatograma obtinută este prezentată in figura 2. Din figura se observă eluarea la timpi de retenţie diferiţi si distanţaţi, ceea ce evidenţiază faptul ca metoda permite o bună separare a amestecului de amine.anexăm cromatogramele HPLC obţinute cu soluţia martor (solvent), si soluţia de lucru, în aceleaşi condiţii. Fig 1.Cromatograma HPLC pentru soluţia martor(solvent) Fig 2.Cromatograma HPLC pentru soluţia de lucru.
Metoda alesă pentru izolarea si concentrarea aminelor biogene din produsele alimentare permite o extracţie al carui randament este de 79% pentru histamina, 74%pentru tiramina, 83% pentru cadaverina si 82% pentru putresceina. Metoda prezintă o buna reproductibilitate si o regăsire bună atat la concentraţii mari cat si concentraţii mici (aşa cum este situatia in cazul produselor alimentare). Metoda de extracţie a fost validată, parmetrii de validare indeplinind criteriile cerute de Food and Drug Administration, SUA (FDA) si European Agency for the Evaluation of of Medicinal Products on Evaluation of Medicines for Human Use ( EMEA).