ING. CALBOREANU (căs. Badea) CARMEN REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT SUMMARY

UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA FACULTATEA DE HORTICULTURĂ ING. CALBOREANU (căs. Badea) CARMEN REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT SUMMARY DETERMINAREA VARIABILITATĂŢII LA NIVEL FENOTIPIC ŞI LA NIVEL MOLECULAR A LINIILOR DE PORUMB ZAHARAT, COMPONENTE ALE PRINCIPALILOR HIBRIZI COMERCIALI CREAŢI LA SCDA TURDA, ÎN VEDEREA STABILIRII EFICIENŢEI SELECŢIEI ASISTATE DE MARKERI A LINIILOR CONSANGVINIZATE PHENOTYPIC AND MOLECULAR VARIABILITY OF SWEET CORN INBRED LINES, COMPONENT OF MOST IMPORTANT COMERCIAL HYBRIDS CREATED AT ARDS TURDA, IN ORDER TO ESTABLISH THE EFFICIENTCY OF MARKER ASSISTED SELECTION OF INBRED LINES Conducător ştiinţific: Prof. univ. dr. MARIN ARDELEAN 1

INTRODUCERE Porumbul zaharat este o varietate în cadrul speciei Zea mays, şi anume var. rugosa (Bonaf), convar. Saccharata (Sturt.), (după SĂVULESCU şi ZAHARIDI, 1957) şi se diferenţiază de porumbul normal prin prezenţa uneia sau mai multor gene mutante, care afectează metabolismul glucidelor din endosperm. În ţara noastră, cercetările legate de ameliorarea porumbului zaharat au început la I.C.C.P.T. Fundulea, în anul 1957 (MUREŞAN şi colab., 1966). Porumbul zaharat apare menţionat în lucrarea Porumbul - Studiu monografic publicată de către SĂVULESCU şi ZAHARIDE în 1957. Primul hibrid de porumb zaharat obţinut în România, la Fundulea, a fost hibridul simplu Delicios, omologat în anul 1969. În anul 1971, la Staţiunea de Cercetări Agricole Turda, s-a iniţiat programul de creare a liniilor consangvinizate şi a hibrizilor timpurii de porumb zaharat, iar în anul 1988 a fost omologat hibridul triliniar Dulcin (CĂBULEA şi colab., 1994; HAŞ şi colab., 1994; HAŞ, 2002a). Linii valoroase sugary se regăsesc în prezent ca forme parentale ale hibrizilor omologaţi Dulcin, Prima, Estival şi Deliciul Verii (HAŞ şi CĂBULEA, 1998, HAŞ, V. şi colab., 1999). Identificarea polimorfismului liniilor consangvinizate cu ajutorul polimorfismului la nivel de ADN este extrem de utilă, datorită faptului că rezultatul obţinut reflectă direct genotipul şi nu este influenţat de condiţiile de mediu (LODHI şi colab.1994, POP şi colab., 2003). Pe baza celor constatate mai sus, în teza de doctorat prezentată ne-am propus să ducem mai departe cercetările naţionale menţionate mai sus, prin evidenţierea variabilităţii liniilor consangvinizate de porumb zaharat, nu numai la nivel fenotipic ci şi la nivel molecular şi stabilirea legăturilor statistice între aceste două tipuri de manifestare. Astfel de legături ar putea fi folosite la iniţierea unui program de selecţie asistată de markeri moleculari ai liniilor componente ale hibrizilor comerciali de porumb zaharat. 2

1. OBIECTIVELE CERCETĂRII, MATERIALUL ŞI METODA 1.1. SCOPUL CERCETĂRILOR Orice program de ameliorare îşi propune crearea unei noi variabilităţi genetice care să poată fi folosită ulterior prin selecţie pentru obţinerea de genotipuri noi mai, performante. Sporul de producţie, la porumbul zaharat, reprezintă un câştig modest comparativ cu cel realizat la porumbul normal, după aprecierea făcută de către TRACY (1990b), datorită bazei genetice mai înguste a porumbului zaharat, care limitează posibilităţile câştigului genetic pentru producţie. Scopul principal al cercetărilor noastre a constat în caracterizarea şi stabilirea relaţiilor filogenetice între cele 18 linii consangvinizate şi cei 49 de hibrizi de porumb zaharat, cu ajutorul metodologiei RAPD, precum şi compararea rezultatelor obţinute prin formule de hibridare elaborate pe baza testării liniilor şi hibrizilor comerciali prin metode convenţionale şi prin metode neconvenţionale (markeri moleculari). Cercetările iniţiate de noi, constituie, probabil, primele încercări de identificare a variabilităţii la porumbul zaharat prin metoda RAPD, în România. 1.2. OBIECTIVELE URMĂRITE ÎN CERCETĂRILE AFERENTE TEZEI DE DOCTORAT În cercetările iniţiale ne-am propus ca, prin experienţele efectuate la 18 linii consangvinizate şi 49 de hibrizi de porumb zaharat, să identificăm şi să selectăm un material biologic adecvat pentru obţinerea unor combinaţii performante, care presupun manifestarea la maxim în cadrul hibrizilor a celor mai valoroase caractere ale liniilor parentale. Având ca repere fundamentale cunoştiinţele privind importanţa şi actualitatea cercetărilor cu privire la difersitatea fenotipică şi genetică a liniilor consangvinizate şi a hibrizilor simpli, la metodele de analiză, obiectivele urmărite în această lucrare sunt prezentate după cum urmează, pe două categorii de caracterizare a liniilor consangvinizate şi a hibrizilor de porumb zaharat studiaţi: fenotipic şi molecular. 3

La nivel fenotipic s-a urmărit: caracterizarea liniilor consangvinizate de porumb zaharat pe baza valorii per se a lor dar şi pe baza indicelui fenotipic de diferenţiere; evaluarea diversităţii genetice a caracterelor cantitative a liniilor consangvinizate de porumb zaharat forme parentale ale hibrizilor studiaţi pe baza capaciţăţii generale şi specifice de combinare. stabilirea gradului de diversitate genetică dintre formele parentale prin nivelul de intensitate al heterozisului hibrizilor de porumb zaharat; precizarea influenţei condiţiilor de mediu asupra mecanismelor genetice implicate în exprimarea caracterelor la porumbul zaharat. Pentru caracterizarea moleculară a liniilor consangvinizate şi a hibrizilor de porumb zaharat studiaţi ne-am îndreptat cercetările în direcţia următoarelor aspecte: stabilirea protocolului de extracţii de ADN şi utilizarea tehnicii RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) în vederea identificării polimorfismului genetic in vivo la 18 linii de porumb zaharat şi 49 de hibrizi simpli; identificarea primerilor capabili să determine polimorfismul la nivel molecular între liniile consangvinizate şi între hibrizii analizaţi; depistarea diversităţii genetice şi a gradului de înrudire între cele 18 linii consangvinizate, precum şi între hibrizii de porumb zaharat studiaţi, prin amprenta ADN obţinută cu ajutorul tehnicii RAPD; De asemenea, urmărim să evidenţiem tipul de legătură existentă între capacitatea generală şi specifică de combinare calculată la nivel fenotipic pe de o parte şi amprenta genetică a liniilor consangvinizate de porumb zaharat, pe de altă parte 2. MATERIALE ŞI METODE DE LUCRU 2.1 MATERIALUL BIOLOGIC Materialul biologic utilizat în cercetările realizate a fost reprezentat de 18 linii consangvinizate de porumb zaharat (T152 su, T193A su, T209 su, T339R su, LC153 su, LC154 su, TD101 su, T345R su, T346 su, TA25 su, TA26 su, TA27 su, TA28 su, TA22 su, TA21 su, T233 su, T244 su, TC209 su) forme parentale şi 49 hibrizi simpli 4

realizaţi în cadrul unui sistem ciclic (factorial) de încrucişare de tipul m x n destinat analizei genetice cantitative, liniile tester fiind liniile T233 su, T244 su şi TC209 su. Materialul biologic destinat izolării ADN-ului a fost reprezentat de embrionii genotipurilor de porumb zaharat mai sus menţionate. Pentru completarea grilajului patrat balansat s-au mai introdus în testare încă patru hibrizi simpli de porumb zaharat, trei dintre ei omologaţi şi cuprinşi în Lista oficială a soiurilor şi hibrizilor (Prima, Deliciul verii şi Delicios) şi încă un hibrid simplu de porumb zaharat, forma maternă a hibridului Estival, linia componentă acestui hibrid simplu SW87 su (a 19 linie), a fost şi ea analizată la nivel molecular prin tehnica RAPD. Pentru amplificare s-au utilizat 20 primeri decameri (UBC 281, UBC 241, UBC 245, UBC 561, UBC 286, UBC 599, OPB08, OPB09, OPB10,OPB11OPB17,OPAB 11,OPX O3, AB 11, OPE 14, OPAL 20,OPB03, OPB18, OPC14, OPD19). Provenienţa primerilor a fost diferită, astfel 6 primeri decanucleotidici sunt produşi de University of British Columbia (UBC), 14 de Mycroshinth (OPAB, OPA, OPB, OPE, OPC, OPD, OPAL, OPX, AB,). 2.2. METODE DE LUCRU 2.2.1.Organizarea experienţelor Cercetările privind determinismul genetic precum şi studiul efectelor capacităţii generale şi specifice de transmitere a unor caractere de interes specific pentru porumbul zaharat s-au realizat utilizând datele experimentale dintr-o serie de trei sisteme ciclice, cuprinzând 45 de hibrizi. Pe lângă aceştia s-au mai introdus în studiu patru hibrizi simpli (omologaţi) de porumb zaharat (Prima, Deliciul verii, Delicios şi forma mamă a hibridului Estival), pentru a completa sistemul de aranjare (49 variante = 7 x 7 şi (7 +1)/2 repetiţii) în câmp, dar şi pentru utilizarea lor pentru comparare cu restul hibrizilor sistemului în vederea evidenţierii unui progres genetic. 5

Liniile consangvinizate forme parentale au fost, de asemenea, experimentate în anii 2005 şi 2006, într-o experienţă cu blocuri randomizate într-o singură localitate (Turda), în patru repetiţii. Testarea hibrizilor s-a realizat, şi ea, pe parcursul aceloraşi doi ani: 2005 şi 2006. 2.2.2. Observaţii şi analize Observaţiile şi analizele realizate, la variantele experimentale în anii 2005 şi 2006, au vizat pentru un număr de 25 de caractere. Măsurătorile au fost efectuate la maturitatea fiziologică (aproximativ 21 zile de la apariţia stigmatelor) la câte 10 plante şi 10 ştiuleţi din ficare parcelă repetiţie, totalizând 40 de plante şi 40 de ştiuleţi / variantă (hibrid simplu)/an: caracterele vegetative ale plantei :înălţimea plantei, înălţimea de inserţie a ştiuletelui principal, numărul de frunze/plantă, numărul de ramificaţii la panicul, lungimea frunzei ştiuletelui principal, lăţimea frunzei ştiuletelui principal, numărul de lăstari / plantă; caracterele ştiuletelui :greutatea ştiuletelui, greutatea pănuşilor, lungimea ştiuletelui, lungimea pănuşilor, lungimea bracteelor, numărul de rânduri de boabe/ ştiulete, profunzimea, grosimea rahisului, indicele de conicitate; caracteristici fiziologice: vigoarea vegetativă timpurie, suprafaţa foliară 2.2.3. Metodologia analizelor RAPD utilizate în evidenţierea variabilităţii la nivel molecular la porumbul zaharat 2.2.3.1. Metode de extracţie a ADN-ului Pentru analiza RAPD a ADN-ului, la porumbul zaharat (bogat în glucide), s-a încercat extracţia acestuia prin două metode: din embrioni şi din endosperm. Au fost testate două tipuri de protocoale, apoi s-a optimizat protocolul de extracţie a ADN-ului ales prin care se obţine o puritate cât mai mare. Materialul biologic destinat izolării 6

ADN a fost reprezentat de embrionii boabelor de porumb zaharat a materialului biologic prezentat mai sus. Pentru a obţine un ADN de calitate care să poate fi utilizat în tehnica RAPD- lui a fost utilizat protoculul descris de LODHI şi colab., 1994, modificat (POP şi colab., 2003). 2.2.3.2. Cuantificarea ADN-ului După extracţia ADN-ului, probele au fost cuantificate spectofotometric cu ajutorul aparatului BioPhotometer Eppendorf. 2.2.3.3. Protocol de amplificare RAPD Amplificarea probelor s-a realizat în aparatul Eppendorf Mastercycler gradient programat astfel: 3 minute la 95 0 C predenaturare, urmată de 45 de cicluri cu următorul profil de temperatură : 1 minut la 93 0 C denaturare 1 minut la 34 0 C fixarea primerilor 1 minut la 72 0 C extensie extensia finală 10 minute la 72 0 C. 2.2.3.4. Analiza imaginilor Analiza gelurilor s-a făcut cu ajutorul programului Total Lab TL 100, obţinându-se matricea binară. Matricea binară s-a utilizat apoi pentru calcularea distanţelor genetice. Pentru calcularea distanţelor genetice şi realizarea dendrogramei s-a utilizat programul RAPDistance 1.04, utilizând cu aplicarea coeficientului Nei Li şi a metodei UPGMA (Un-weighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) pentru distanţele genetice, respectiv metoda Neighbor Joining Tree pentru dendrogramă. 7

2.2.4. Metode statistice utilizate în evidenţierea variabilităţii fenotipice şi genetice la porumbul zaharat Pentru a putea evalua diversitatea fenotipică a celor 18 linii consangvinizate implicate în sistemul de încrucişări experimentat la SCDA Turda, s-a calculat indicele de diferenţiere fenotipică (IDF) după HERBERT şi VINCOURT (1985). unde X m, X n mediile caracterelor liniilor parentale m şi n. La nivelul caracterelor cantitative diversitatea genetică s-a estimat pe baza capacităţii generale de combinare (CGC) şi a capacităţii specifice de combinare (CSC) caracteristice fiecărei linii, fiecărei interacţiuni dintre linii, şi pentru sistem ciclic (factorial) de încrucişare. Estimarea diversităţii poligenice s-a realizat: - la nivelul locilor homozigoţi prin calcularea efectelor genice aditive (ĝ ), în care X m/n = media valorilor părintelui m sau n;. - la nivelul interacţiunilor intra şi interalelice prin calcularea efectelor genice neaditive (ŝ mn ) ), unde ŝ mn = efectul genetic al interacţiunii genelor celor doi părinţi; 2.2.5. Metode statistice utilizate în evidenţierea variabilităţii la nivel molecular Interpretarea gelurilor obţinute s-a făcut prin analiza statistică a imaginilor. Markerii moleculari sunt trataţi ca variabile binare, în procesarea datelor luându-se în considerare următoarele: 8

- se foloseşte analiza mai multor variante, formându-se matrici de similaritate sau diferenţiere între posibilele perechi de indivizi sau unităţi taxonomice operaţionale; - doi indivizi similari au simultan valoarea minimă a distanţei şi maximă a similitudinii; - distanţa şi similitudinea sunt invers proporţionale; - similaritatea este estimată în funcţie de numărul coincidenţelor. 3. REZULTATE ŞI DISCUŢII 3.1. CARACTERIZAREA FENOTIPICĂ ŞI MOLECULARĂ A LINIILOR CONSANGVINIZATE DE PORUMB ZAHARAT LUATE ÎN STUDIU 3.1.1. Exprimarea fenotipică a caracteristicilor liniilor consangvinizate de porumb zaharat Valorile medii calculate a caracterelor de interes pentru ameliorarea porumbului zaharat acoperă biometrizările pe o perioadă de doi ani (2005 şi 2006), perioadă pe parcursul căreia s-au efectuat experienţele. Aceste valori redau valoarea per se a caracterului respectiv la liniile consangvinizate studiate. Caracterizarea fenotipică a liniilor consangvinizate forme parentale de porumb zaharat luate în studiu la SCDA Turda este redată în tabelele 1 prin calcularea valorilor medii a biometrizărilor a şase caractere la plantă şi a 12 caractere la ştiulete. Piaţa prezintă cerinţe esenţiale legate de aspectul ştiuletelui. Astfel, pentru consum proaspăt, se preferă porumbul cu cel puţin 16 rânduri de boabe mici, profunde, rândurile să fie drepte, ştiuletele de 25-30 cm, acoperit cu boabe până la vârf iar forma ştiuletelui să fie cilindrică (TRACY, 1994). În tabelul mai sus menţionat se poate observa că între liniile consangvinizate de porumb zaharat studiate există diferenţe asigurate statistic privind fiecare caracter în parte. 9

Înălţimea plantelor s-a exprimat prin valori cuprinse între 97,40 cm (TA27su) şi 155,53 cm (T244 su). Înălţimea de inserţie a ştiuletelui principal a avut valori cuprinse 16,21 cm (TA 27 su) şi 53,62 cm (T152 su). Tabelul 1 Caracterele vegetative ale plantei şi ştiuletelui la liniile consangvinizate parentale de porumb zaharat (valori medii Turda, 2005 şi 2006) Agronomic assessments of sweet corn inbred lines studied (average values Turda 2005 and 2006) Linia Înălţime plantă Înălţime inserţie ştiulete Height ear insertion (cm) Număr ramificaţii la panicul Greutate ştiulete fără pănuşi Lungime ştiulete Dehusked ear Ear lenght Line Plant height Branch of weight (cm) tassel no. (g) (cm) T152su 143,62 *** 53,62 *** 5,51 ooo 87,93 15,88 *** T193Asu 147,26 *** 50,78 *** 9,75 oo 80,75 12,65 T209su 123,35 36,49 8,48 ooo 87,11 13,50 T339Rsu 137,87 *** 42,66 10,05 o 87,95 16,90 *** LC153su 117,39 ooo 44,18 36,21 *** 80,60 11,47 ooo LC154su 120,48 oo 41,23 17,70 *** 71,87 o 13,40 TD101su 128,68 38,99 22,56 *** 82,70 16,44 *** T345Rsu 122,00 o 41,58 9,79 oo 89,96 13,46 T346su 152,70 *** 51,59 *** 10,48 81,69 16,19 *** TA25su 106,27 ooo 32,33 o 13,97 * 90,48 12,12 oo TA26su 131,38 * 35,97 10,73 78,32 12,04 oo TA27su 97,40 ooo 16,21 ooo 7,42 ooo 90,06 14,53 TA28su 108,11 ooo 29,48 ooo 6,16 ooo 115,78 *** 11,38 ooo TA22su 134,51 ** 36,99 8,86 ooo 89,79 12,21 oo TA21su 104,44 ooo 29,41 ooo 13,36 61,65 ooo 11,61 ooo T233su 110,77 ooo 30,86 oo 9,48 oo 87,27 12,71 T244su 155,53 *** 47,44 ** 8,84 ooo 90,03 13,35 TC209su 141,19 *** 41,16 9,81 oo 91,56 16,07 *** Media 126,83 38,94 12,18 85,86 13,66 DL/LSD 5% 4,52 5,46 1,72 11,9 1,03 DL/LSD 1% 6,01 7,24 2,29 15,8 1,37 DL/LSD 0,1% 7,74 9,34 2,95 20,36 1,76 Numărul de ramificaţii la panicul este un caracter cu o amplitudine destul de largă de la 5,51 (T152 su) la 36,21 (LC153 su). 10

Greutate ştiuletelui fără pănuşi, caracter de producţie deosebit de important, a înregistrat variaţii ale valorilor medii între 61,65 grame (TA21 su) şi 115,78 grame (TA28 su). Mărimea ştiuletelui, caracter important atât pentru producţie cât şi pentru aspectul comercial, a prezentat variaţii ale valorilor medii calculate pe cei doi ani de studiu, (tabelul 1), de la 11,38 cm (TA28 su) până la 16,90 cm (T339R su). Porumbul zaharat pentru consum în stare proaspătă trebuie să prezinte boabe mici şi profunde (TRACY, 1994). Dimensiunea bobului, după cum se observă în fig.1, variază în limite de la 0,5 cm (LC153 su) la 0,76 cm (T346 su). Fig.1. Grosimea boabelor la cele 18 linii consangvinizate de porumb zaharat forme parentale (valori medii anii 2005 şi 2006) Porumbul zaharat pentru consum proaspăt trebuie să prezinte boabe mici şi profunde (TRACY, 1994). La cele 18 linii parentale studiate, se înregistrează valorii medii pe cei doi ani de la 0,40 cm (T152 su) la 0,89 cm (TA27 su, TA28 su). Prin calaculul indicelui de diferenţiere fenotipică (IDF) (HERBERT şi VINCOURT, 1985 se pot compara valorile medii ale caracterelor fenotipice a două genotipuri (linii parentale) (fig.2 şi 3). 11

Fig.2. Indicii de diferenţiere fenotipică (IDF) pentru caracterele plantei la 18 linii consangvinizate de porumb zaharat (anii 2005 şi 2006) Fig.3. Indicii de diferenţiere fenotipică (IDF) pentru caracterele ştiuletelui la 18 linii consangvinizate de porumb zaharat (anii 2005 şi 2006) Valoarea ridicată a acestui indice calculat ne indică gradul de diferenţiere dintre linii în timp ce valorile mai scăzute, gradul de asemănare. Ca urmare, privind caracterele plantei, linia consangvinizată T152su se diferanţiază foarte mult de toate cele trei linii consangvinizate utilizate în sistemul de 12

încrucişare ca formă maternă (T233 su, T244 su şi TC209 su) prin valorile cele mai mari ale indicelui de diferenţiere fenotipică (54,9, 82,1 şi respectiv 71). Cele mai apropiate din punct de vedere fenotipic s-a constatat că sunt liniile TA28 su cu T233 su (6,8), T346 su cu T244 su (8,1), TA22 su cu TC209 su (9,0). Indicele de diferenţiere fenotipică calculat pentru caracterele ştiuletelui de porumb zaharat la liniile consangvinizate studiate sunt prezentate în figura 4. Astfel, se poate observa pe baza acestui calcul că cel mai mare grad de diferenţiere fenotipică la nivelul caracterelor ştiuletelui s-a înregistrat între linia TA21 su şi T244 su (62,6) precum şi între linia T346su şi T233su (58,1), şi respectiv TC209 su (50,2). Foarte asemănătoare din punct de vedere al caracterelor ştiuletelui s-au remarcat liniile T345su şi TC209 su (6,1), T339R su şi T244 su (8,1) precum şi LC153 su şi T233su (8,4). 3.1.2. Caracterizarea liniilor cu ajutorul capacităţii generale de combinare (CGC) Diversitatea genetică la nivelul caracterelor cantitative o putem estima pe baza efectelor capacităţii generale de combinare caracteristice liniilor consangvinizate de porumb zaharat. Diferenţele existente între liniile comparate reflectă diferenţierile la nivelul locilor homozigoţi cu efecte cumulative. Dintre cele trei linii consangvinizate de porumb zaharat utilizate în încrucişări ca forme materne, a rezultat faptul că ele pot fi utilizate ca surse de gene favorabile, avnd capacitatea de a transmite aditiv pozitiv caracterele după cum urmează: capacitatea de producţie, reprezentată prin greutatea ştiuletelui este transmisă aditiv pozitiv cel mai bine de linia su TC209 (ĝ =17,19), în timp ce liniile T244 şi T233 transmit negativ aditiv acest caracter; talia plantei este transmisă aditiv pozitiv de linia zaharată TC209 (ĝ=3,21), în timp ce înălţimea mai redusă poate fi transmisă de linia zaharată T244 (ĝ=1,39; Din cadrul liniilor consangvinizate de porumb zaharat, utilizate ca linii paterne putem afirma că: 13

talia plantei este transmisă aditiv pozitiv de liniile zaharate T339R (16,26), T346 (14,34), T152 (7,09), TA22 (6,12) şi T209 (5,30) în timp ce înălţimea mai redusă poate fi transmisă de liniile zaharate LC153, T193A şi T345R; liniile consangvinizate TD101su (4,39), LC153su (4,06), LC154su (3,25) au o capacitate generală de transmitere a unui panicul cu număr mare de ramificaţii în timp ce liniile zaharate TA21, T339R, TA25 şi T345R transmit la hibrizi un număr mai redus de ramificaţii la panicul; Rezultatele privind efectele genetice aditive pentru caracteristicile ştiuletelui de porumb zaharat s-a putut constata că: pentru transmiterea la nivel aditiv a caracterului de producţie exprimat prin greutatea ştiuletelui, pot fi remarcate liniile zaharate LC153 (18,66), T339R (12,76) şi TA25(6,37) în timp ce liniile TA28 (5,51) şi T346 (2,53) transmit o greutate mai redusă a ştiuletelui în descendenţă; caracterul lungimea ştiuletelui este transmis aditiv pozitiv de liniile T209su (2,24), T339Rsu (1,40) şi TD101su (1,34), în timp ce liniile zaharate T346 (0,40), LC154 (0,39) şi T152 (0,38) transmit un ştiulete mai scurt la hibrizi; 3.1.3. Caracterizarea liniilor cu ajutorul capacităţii specifice de combinare Interacţiunile genice intra şi interalelice s-au determinat cantitativ prin efectele capacităţii specifice de combinare (ŝ mn ) calculate în cadrul sistemului de încrucişări ciclic. Pentru exprimarea cantitativă a nivelului de diferenţiere genică intra şi interalelică, s-a calculat suma acestor efecte specifice pentru caracterele analizate (Σŝ ij ). Astfel s-a reuşit identificarea diferenţierilor între liniile consangvinizate de porumb zaharat la nivel genetic neaditiv, atât pentru trasnmiterea caracteristilor plantei cât şi ale ştiuletelui. Cele mai pronunţate diferenţieri pentru (Σŝ ij ), pentru caracteristicile plantei, manifestă linia T233su în combinaţie cu T193Asu (32,79) ( cea mai pronunţată dierenţiere la nivel genetic neaditiv), TA26su (4,87) şi T152su (4,25). 14

Linia consangvinizată de porumb zaharat T244 se diferenţiază la nivel genetic neaditiv de linia TA27su (11,9), dar şi de liniile LC154 su (9,68), TA21 su (9,42), LC153su (8,88), TA22su (8,61), TA28su (8,58), T339Rsu (8,12), TA26su (4,67). Cea mai apropiată, pentru linia zaharată T244, la nivel intra şi interalelic pentru caracterele plantei s-a constatat a fi linia T193Asu (-49,30). Faţă de linia consangvinizată de porumb zaharat TC209, din punctul de vedere al acţiunilor genice intra şi interalelice, după valoarea (Σŝ ij ), se diferenţiază la nivelul de transmitere neaditive a caracterelor plantei, liniile zaharate de tip sugarry: T193A (16,51), T345R (7,85), TD101 (6,52), TA22 (5,21), T209 (3,71). Analiza genetică la nivel neaditiv pentru cele trei linii consangvinizate de porumb zaharat, forme materne din cadrul sistemului factorial de încrucişări, reflectă că cele mai pronunţate diferenţieri pentru valorile sumei efectelor calculate, pentru caracterele ştiuletelui îl manifestă: linia T233su în combinaţie cu T193Asu (105,91); linia T244su în combinaţie cu liniile T339Rsu (37,64), TA27su (37,07), TA22su (23,85), TA21su (19,35), TA28su (15,14); Linia TC209su în combinaţie cu T193Asu (42,84), TA25su (20,62), LC154su (16,21), TA22su (16,72), T345Rsu (9,72). 3.1.4. Exprimarea heterozisului la hibrizii simpli de porumb zaharat aflaţi în studiu la SCDA Turda Pentru greutatea ştiuletelui, în medie pe sistemul experimental, la liniile parentale s-a înregistrat o greutate medie a ştiuletelui de 85,86 grame în timp ce la combinaţiile hibride aceasta este de 168,45 grame. Amplitudinea valorilor înregistrată la hibrizi este cuprinsă între 92,4 grame (T244su x T193Asu) şi 206,69 grame la hibridul (TC209su x LC153su) în timp ce la linii se înregistrează valori cuprinse între 61,65 grame şi 115,78 grame. În toate cazurile, combinaţiile hibride depăşesc media formelor parentale. Totuşi există şi cazuri în care diferenţele între valoarea medie a părinţilor şi a hibrizilor este relativ redusă (T244su x T193Asu, 85,39 respectiv 92,4). Ca urmare, heterozisul este şi el slab manifestat (8,2%). 15

O explicaţie ar fi aceea că liniile forme parentale ale hibrizilor simpli sunt obţinute prin autopolenizare şi selecţie din hibrizi simpli. Astfel, aceste linii au încorporate blocuri poligenice aparţinând la grupe heterotice diferite, ceea ce le conferă o valoare a caracterului per se dar există şi o probabilitate ridicată de lipsă de diferenţiere (HAŞ, 1999). Heterozisul producţiei cu cele mai ridicate valori procentuale s-a înregistrat în general la hibrizii a căror mamă a fost TC209su: TC209su x LC153su (140,10%), TC209su x TA26su (127,35%), TC209su x TA27su (125,14%), dar şi la hibrizii care au avut ca formă maternă linia sugary T233 (T233su x T346su 118,09%; T233su x LC153su 117,33%, T233su x T3339Rsu 101,34%) sau linia T244su (T244su x LC153su -108,5%; T244su x T339Rsu 106,8%; T244su x TA26su 103,03%). Valori superioare ale heterozisului s-au înregistrat şi în cazul profunzimii bobului (14,53% şi 138,57%). 3.1.5.Exprimarea unor caractere de producţie ale genotipurilor în relaţie cu condiţiile de mediu la hibrizii simpli de porumb zaharat aflaţi în studiu la SCDA Turda Datele privind influenţa hibridului, a anului asupra greutăţii ştiuletelui au fost prelucrate statistic. Din analiza statistică rezultă că ambii factori experimentali (an, genotip), precum şi interacţiunile simple şi duble dintre aceştia au avut influenţe semnificative asupra greutăţii ştiuletelui, greutăţii pănuşilor, lungimii ştiuletelui, numărului de rânduri de boabe/ştiulete. După cum se remarcă din imaginea de mai sus (fig.4), greutatea pănuşilor este mai mult influenţată de condiţiile pedoclimatice, anul având o pondere mai mare în manifestarea acestui caracter. Lungimea ştiuletelui este un caracter important în ceea ce priveşte producţia dar şi aspectul ştiuletelui (foarte important pentru comercializare). 16

Fig.4. Cota de participare (%) a unor factori implicaţi în exprimarea greutăţii ştiuletelui şi a greutăţii pănuşilor la cei 49 de hibrzi de porumb zaharat, studiaţi în anii 2005 şi 2006 Influenţa factorilor şi a interacţiunii simple şi duble dintre aceştia este semnificativă. Din figura 5 putem observa că ponderea factorului B (genotipul) este ce mai mare (61%), ceea ce denotă că anii au avut o influenţă mai puţin pregnantă în manifestarea acestui caracter (lungimea ştiuletelui). Fig.5. Cota de participare (%) a unor factori implicaţi în exprimarea lungimii ştiuletelui şi a numărului de rânduri de boabe pe ştiulete la cei 49 de hibrzi de porumb zaharat, studiaţi în anii 2005 şi 2006 Şi în cazul numărului de rânduri de boabe/ştiulete (fig.5), genotipul a avut ponderea de influenţă cea mai mare (84%), faţă de an (7%) sau interacţiunea acestor doi factori (3%). Ponderea majoritară a contribuţiei genotipului în exprimarea caracterelor analizate ne sugerează faptul că hibrizii de porumb zaharat au o comportare relativ stabilă, în condiţii diferite de mediu, în privinţa caracterelor şi a genotipurilor analizate (HAŞ, 1999). 17

3.1.6. Caracterizarea liniilor consangvinizate pe baza analizelor RAPD 3.1.6.1. Rezultate privind extracţia şi cuantificarea ADN-ului După extracţia ADN-ului s-au făcut cuantificările la spectofotometru Eppendorf BioPhotometer, la lungimea de undă de A260/A280. În cazul liniilor de porumb analizate se constată că cele mai bune rezultate, în ceea ce priveşte cantitatea şi puritatea de ADN se obţin din embrioni prin aplicarea protocolului după metoda Lodhi modificat de extracţie. În ceea ce priveşte cantitatea de ADN obţinută, cele mai mari valori s-au înregistrat în cazul utilizării ca material biologic embrionii, prin utilizarea primului protocol de extracţie (Lodhi modificat). Astfel din embrioni s-au obţinut cantităţi de 7893 12000 ng/μl, în timp ce din endosperm valorile au fost mai mici respectiv între 3450-4370 ng/ μl. În acest caz puritatea a avut valori de 1,5 şi 2. Extracţia realizată cu protocolul după metoda Barry Miller, din endosperm, a reuşit obţinerea unui ADN a cărui puritate a avut valori între 1,45-1,5, iar din extracţiile din embrioni puritatea ADN-ului s-a situat între valorile 1,2-1,7. Ca urmare, extracţia de ADN s-a realizat la toate celelalte genotipuri numai din embrioni şi utilizând protocolului elaborat de LODHI şi colab, modificat (POP şi colab., 2003). Cantitatea de ADN obţinută a fost corespunzătoare (1275 ng/μl şi 10593 ng/μl), având în vedere că pentru amplificare s-au utilizat 50 ng. Puritatea ADN-ului a fost, de asemenea, corespunzătoare fiind cuprinsă între 1,52 şi 2,01. Extracţia de ADN s-a făcut, la liniile consangvinizate de porumb zaharat, din embrioni, în tabelul 20 fiind prezentate rezultatele numerice privind cantitatea de ADN şi puritatea acestuia. 3.1.6.2. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie Pentru amplificarea probelor s-au folosit cei 20 primeri care au dat benzi polimorfice în cazul extracţie de ADN doar 6 dintre ei (OPB10, OPAB11, UBC241UBC 286, OPB 17, AB 11). 18

Amplificarea probelor s-a făcut în trei repetiţii pentru fiecare primer. Interpretarea gelurilor obţinute s-a făcut prin analiza statistică a imaginilor. În analiza statistică s-au inclus doar benzile cu o intensitate luminoasă mare. ADN-ul standard utilizat constă din 40 de fragmente cuprinse între 100 şi 4000 pb. În urma comparării cu ADN-ul standard s-a putut stabili mărimea fiecărui fragment amplificat. Fig. 6. Produşii de amplificare obţinuţi cu primerul UBC286, 1 T346; 2- TA21; 3 TC209; 4 TA25; 5-TA28; 6 T339R; 7 T193A; 8 T209; 9 TD101; 10-TA26, 11 SW87; 12-T152; 13 T233, 14 T345R, 15 T244, 16 LC153; 17-TA22, 18 LC154, 19-TA27. Primerii care au relevat polimorfism între genotipuri sunt: OPB 10 cu 7 benzi polimorfice, OPAB 11 cu 9 benzi polimorfice, UBC 241 cu 10 benzi polimorfice, UBC 286 cu 12 benzi polimorfice, OPB 17 cu 8 benzi polimorfice, AB 11 cu 10 benzi polimorfice. Cele mai multe benzi polimorfice s-au obţinut cu primerul UBC 286 (figura 6). Fragmentele rezultate prin amplificarea cu primerii polimorfici au avut lungimea cuprinsă între 200 şi 2000 pb, majoritatea având între 300 şi 1200 pb. Din figurile prezentate reiese în mod clar că, la toate liniile consangvinizate de porumb zaharat analizate, există diferenţe notabile de structură genetică, relevate de markeri RAPD. Cu cât valorile distanţelor genetice calculate sunt mai mici, cu atât liniile consangvinizate sunt mai strâns înrudite (mai apropiate genetic). Ca urmare, liniile TA27su şi TD101su prezintă cel mai mare grad de apropiere genetică, având valoarea distanţei genetice cea mai mică (0,02), conform analizei moleculare. La fel şi liniile zaharate LC153 şi TA22 sunt foarte îndepărtate filogenetic, având distanţa genetică calculată, cu ajutorul markerilor moleculari RAPD, cea mai mare (0,32). De asemenea 19

distanţe genetice mari se înregistrează cu ajutorul acestor markeri moleculari şi între liniile zaharate LC153 şi SW87 (0,3), T233(0,3), TC209 (0,28), T193A (0,27) precum şi între LC154 şi TA22 (0,28), SW87 şi T233 (0,26). În cadrul dendrogramei (figura 7) se constată că liniile LC153su şi LC154su formează un grup separat faţă de celelalte linii consangvinizate studiate, cea mai mare depărtare filogenetică fiind înregistrată faţă de liniile TA22su, T346su, TC209su. Faptul că liniile TA25su, TA26su şi TA27su se găsesc în acelaşi grup al dendrogramei, iar distanţele genetice sunt mici, nu fac decât să confirme acurateţea rezultatelor experimentale obţinute, aceste linii consangvinizate de porumb zaharat fiind de provenienţă comună. Mai mult, analizând originea liniilor, constatăm veridicitatea analizelor moleculare, liniile TA26su şi TA27su fiind mai apropiate în cadrul aceluiaşi grup, cu atât mai mult cu cât originea lor (genealogia) este mai apropiată. Se poate afirma, pe baza rezultatelor discutate în acest subcapitol că analizele RAPD reprezintă un instrument sensibil de identificare, la nivel molecular, a variabilităţii între liniile consangvinizate de porumb zaharat. 20

TA22 T346 TC209 T209 TA28 TA21 TA25 T193A T339R TA27 TA26 TD101 SV87 T152 T345R T233 T244 LC153 0.1 LC154 Fig. 7. Dendrograma obţinută la liniile consangvinizate de porumb zaharat studiate 3.1.7. Eficienţa selecţiei asistate de markeri a liniilor consangvinizate de porumb zaharat În scopul ilustrării selecţiei asistate de merkeri a liniilor consangvinizate de porumb zaharat s-au calculat coeficienţii de regresie lineară dintre distanţele genetice între liniile parentale şi performanţele hibrizilor obţinuţi din liniile respective. S-a pornit de la idea că un coeficient de regresie semnificativ indică o legătură de creştere/descreştere reală între valorile distanţelor genetice şi performanţele hibrizilor pentru caracterele luate în studiu. În cazul testării capacităţii specifice de combinare, selecţia asistată de markeri RAPD s-a dovedit eficientă pentru caractere ce constituie importante elemente de productivitate la porumbul zaharat (greutatea ştiuletelui, lungimea ştiuletelui şi numărul de boabe/rând) şi mai puţin sau total ineficientă pentru înălţimea plantei, 21

numărul de rânduri/ştiulete şi profunzimea bobului. Este clar că, în funcţie de testerii folosiţi, trebuie găsiţi markerii RAPD a căror eficienţă în selecţia asistată de markeri să fie maximă, pentru toate caracterele de interes în ameliorarea acestei varietăţi de porumb. 4. CONCLUZII Pe baza rezultatelor obţinute s-au putut formula câteva concluzii şi recomandări asupra anumitor aspecte, cu privire la variabilitatea liniilor consangvinizate analizate, importante pentru procesul ameliorării porumbului zaharat. 1. Pentru caracterele vegetative ale plantei (înălţimea plantei, înălţimea de inserţie a ştiuletelui, numărul total de frunze pe plantă, suprafaţa foliară, numărul de ramificaţii la panicul, numărul de lăstari pe plantă) cu efecte genice care pot fi transmise aditiv, pot fi remarcate liniile: T244, TC209, T339R, LC153, LC154, T346 şi T345R. 2. Liniile care pot transmite efecte genice aditiv pentru caracterele vegetative ale ştiuletelui (greutatea ştiuletelui, lungimea ştiuletelui, greutatea pănuşilor, diametrul ştiuletelui, număr rânduri de boabe pe ştiulete, profunzimea bobului) sunt: T339R, LC153, T346, TA27 şi TA28. 3. Interacţiunile genice intra şi interalelice s-au determinat cantitativ prin efectele capacităţii specifice de combinare, astfel că cele mai pronunţate diferenţieri la nivel genetic neaditiv le manifestă liniile: T233 în combinaţie cu T193A, TA26 şi T152; T244 în combinaţie cu TA27, LC154, TA21, LC153, TA22, TA28, T339R, TA26; TC209 în combinaţie cu T193A, T345R, TD101, TA22, T209. 4. În studiul realizat asupra 49 de hibrizi simpli direcţi, valorile superioare ale heterozisului s-au înregistrat în cazul greutăţii ştiuletelui la combinaţiile hibride: TC209 x LC153 (140,10%), TC209 x TA26 (127,35%), TC209 x TA27 (125,14%) dar şi la combinaţiile: T244 x LC153 (108,5%); T244 x T339R (106,8%); T244 x TA26 (103,03%) 22

5. Alegerea primerilor s-a dovedit destul de dificilă, din cei 20 primeri doar 6 au relevat polimorfism între genotipuri; 6. Distanţele genetice cele mai mari au fost înregistrate între liniile consangvinizate de origini diferite (LC153 şi TA22), în timp ce distanţele genetice mici arată o înrudire mai mult sau mai puţin apropiată între liniile respective (TA27 cu TD101, LC153 cu LC154 dar şi TA26 cu TA27) analiza RAPD fiind în general în concordanţă cu datele cu privire la originea materialului analizat. 7. Pentru importante elemente de productivitate la porumbul zaharat, precum greutatea ştiuletelui, lungimea ştiuletelui şi numărul de boabe/rând, selecţia asistată de markeri RAPD poate înlocui cu succes testarea capacităţii specifice de combinare a liniilor parentale. Această afirmaţie este susţinută prin rezultate pozitive, asigurate statistic, a coeficienţilor de regresie liniară dintre distanţele genetice între liniile parentale şi performanţele hibrizilor obţinuţi din liniile respective pentru caracterele de interes. 8. Pe baza acestor rezultate se poate conchide că selecţia asistată de markeri moleculari nu poate, în mod eficient, să înlocuiască testarea capacităţii generale de combinare. Pe de o parte, testerii au capacităţi diferite de a reliefa valoarea liniilor consangvinizate testate, iar pe de altă parte, testarea CGC constituie un mod eficient de a elimina din etapele următoare de lucru liniile care, la modul general, au o slabă capacitate combinativă. 23