RISCOS RELACIONADOS COA EXPOSICIÓN A AXENTES BIOLÓXICOS: A SÚA AVALIACIÓN E CONTROL

Transcription

1 RISCOS RELACIONADOS COA EXPOSICIÓN A AXENTES BIOLÓXICOS: A SÚA AVALIACIÓN E CONTROL Risgos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos 3

2 Depósito legal C-2181/04 ISBN Deseño e maquetación: Segaof Servicios, s.l. Imprime: Segaof Servicios, s.l. Autores: Jesús Torres Pombo Doutor en Química Técnico superior de prevención Antonio Lama Varela Licenciado en Bioloxía Técnico superior de prevención Centro de Seguridade e Saúde Laboral de Pontevedra P.V.P.: 7

3 PRESENTACIÓN PRESENTACIÓN É para min unha satisfacción presentar esta 3ª edición do libro. A súa avaliación e control, que, con amplitude e claridade, aborda o tema da avaliación e control dos riscos biolóxicos no lugar de traballo. No campo das ciencias da saúde utilízase a expresión saúde laboral para facer referencia ao estado de saúde dun individuo en relación co ambiente do lugar de traballo. Dentro deste campo, a hixiene industrial, como disciplina dedicada á prevención das enfermidades laborais, ocupa un lugar preeminente. Nun concepto máis amplo, segundo a definición de 1959 da American Industrial Hygiene Association, a hixiene industrial ocúpase da identificación, avaliación e control daqueles factores ou axentes ambientais orixinados polo posto de traballo ou presentes neste, que poden causar enfermidade, diminución da saúde ou do benestar, ou incomodidade ou ineficiencia significativos entre os traballadores ou os restantes membros da comunidade. A expresión hixiene industrial, como se lembra en todos os textos que se refiren a esta materia, non só engloba o termo industrial en sentido estrito, senón que se refire a calquera traballo ou actividade. Nos últimos anos a utilización de axentes biolóxicos nos procesos produtivos experimentou un incremento importante, que trae como consecuencia que a hixiene industrial debe controlar non só os axentes patóxenos non desexados que están presentes nos lugares de traballo, senón que debe ocuparse tamén, e cada vez en maior medida, dos axentes biolóxicos que forman parte mesma do proceso produtivo. Así mesmo, tamén debe dar resposta a aquelas enfermidades relacionadas coa síndrome do edificio enfermo que están en parte relacionadas coa presenza de axentes biolóxicos no medio laboral. O control do risco biolóxico intégrase dentro da xestión xeral dos riscos laborais, pero precisa de coñecementos 5

4 PRESENTACIÓN concretos e procedementos específicos. Este control esixe identificar todos os axentes biolóxicos que estean ou poidan estar presentes nos lugares de traballo e coñecer a súa perigosidade intrínseca para poder identificar os riscos existentes. Ademais, convén coñecer os mecanismos que forman a cadea da infección para poder actuar eficazmente, interrompendo esta no punto máis axeitado e evitar os seus efectos. Despois da boa acollida que tiveron as dúas primeiras edicións e ante as modificacións que se produciron no campo dos organismos modificados xeneticamente coa aprobación da Lei 9/2003 do 25 de abril, o Real decreto 178/2004 do 30 de xaneiro que aproba o Regulamento xeral para o desenvolvemento de dita lei e a nova norma UNE-EN sobre mostraxe de endotoxinas, os técnicos de prevención do Centro de Seguridade e Saúde Laboral de Pontevedra ofrécenlles con esta nova edición, aos prevencionistas, traballadores e empresarios, uns conceptos e ideas básicas e un conxunto de información bibliográfica actualizada que poidan ser de utilidade á hora de avaliar os riscos biolóxicos e de tomar decisións sobre as medidas de prevención máis convenientes, en aplicación das disposicións que establece o Real decreto 664/1997, do 12 de maio, sobre prevención de riscos biolóxicos. Mª José Cimadevila Cea Conselleira de Asuntos Sociais, Emprego e Relacións Laborais 6

5 PRÓLOGO PRÓLOGO Á TERCEIRA EDICIÓN Esgotada a segunda edición do libro Riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos: a súa avaliación e control, propuxémonos nesta terceira edición incorporar as actualizacións lexislativas no campo dos contaminantes biolóxicos e clarificar aqueles conceptos que nas anteriores edicións estaban algo confusos. Así mesmo, tratamos de incorporar as novas contribucións que realizan os expertos no estudo dos contaminantes biolóxicos, en especial no referido aos criterios de valoración. Nesta edición tívose en conta a modificación lexislativa que se produciu no campo dos organismos modificados xeneticamente coa aprobación da Lei 9/2003, do 25 de abril, pola que se establece o réxime xurídico da utilización confinada, liberación voluntaria e comercialización dos organismos modificados xeneticamente, e do Real decreto 178/2004, do 30 de xaneiro, polo que se aproba o Regulamento xeral para o desenvolvemento e execución da Lei 9/2003. Tamén se modificaron parcialmente todos os capítulos, pero de modo moi especial os referidos aos criterios de valoración, incorporando algunhas guías cuantitativas, e ao control dos contaminantes biolóxicos, que se reordenou e ampliou. Esperamos que, como as anteriores, esta terceira edición siga tendo unha boa acollida e sirva de axuda a todos aqueles que traballan ou se interesan pola prevención de riscos laborais. Pontevedra, 2004 Os autores 7

6 ÍNDICE INTRODUCIÓN OS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Concepto e clasificación Microorganismos Virus Bacterias Fungos Endoparasitos Protozoos Helmintos Cultivos celulares RELACIÓN PARASITO-HOSPEDADOR NAS ENFERMIDADES INFECCIOSAS BACTERIANAS Patoxenicidade: infección e enfermidade Vías de entrada dos contaminantes biolóxicos Barreiras do organismo fronte á invasión dos axentes biolóxicos Barreiras da pel e mucosas Defensa fagocítica Defensa inmunolóxica Depresión da defensa do hospedador Transmisibilidade das infeccións ACTUACIÓN HIXIÉNICA Identificación de riscos (fase primeira) Evaluación do risco (fase segunda) Planificación da actividade preventiva (fase terceira) ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS Traballos en centros de produción de alimentos Industrias lácteas Industrias cárnicas (matadoiros) Industrias de conserva de alimentos Industria da fariña e derivados Industria de procesado de aceites vexetais Traballos agrarios Actividades nas que existe contacto con animais ou con produtos de orixe animal

7 ÍNDICE Traballos de asistencia sanitaria, comprendidos os desenvolvidos en servizos de illamento e de anatomía patolóxica Traballos en laboratorios clínicos, veterinarios, de diagnóstico e de investigación, con exclusión dos laboratorios de diagnóstico microbiolóxico Traballos en unidades de eliminación de residuos Traballos en instalacións depuradoras de augas residuais Riscos biolóxicos noutras actividades Riscos biolóxicos no interior dos edificios Síndrome do edificio enfermo Enfermidades relacionadas cos edificios MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) A necesidade da medición A toma de mostra A estratexia de mostraxe Métodos de toma de mostra de fungos e bacterias Principios de recolección de bioaerosois Impactación Filtración Recollida en medio líquido Características de varios mostreadores de bioaerosois DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL Límite de detección Rango do límite superior Límite de cuantificación Sistemas de mostraxe por impactación Recolector de Andersen Recolector RCS (Reuter Centrifugal System) Mostrador SAS (Surface Air Sampler) Mostrador de fenda (Casella) Outros mostradores de impacto Sistemas de mostraxe por burbullo en medio líquido Sistemas de mostraxe por filtración Mostradores personais Técnicas de mostraxe en superficies Placa de contacto Frotis MOSTRAS DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES Mostraxe de fungos viables en aire

8 ÍNDICE Mostraxe de bacterias viables en aire O cultivo de fungos e bacterias Medios de cultivo Cultivo de fungos Brancos Conservación e transporte das mostras Procedemento para a identificación e cuantificación de bioaerosois cultivables Preparación da mostra Identificación de bioaerosois cultivables Microbioloxía clásica Microbioloxía clínica Procedementos adicionais para a identificación e cuantificación tanto para bioaerosois viables como non viables Microscopía Microscopía óptica Microscopía de contraste de fases Microscopia de fluorescencia Microscopía electrónica Inmunoensaios Radioinmunoensaio Inmunoensaios de fluorescencia Inmunoensaios encimáticos Probas Xenéticas Probas do ADN oligomérico sintético Reacción de cadea da polimerasa (PCR) Análise polimórfico de tramos de fragmentos de restrición Ensaio de endotoxinas CRITERIOS DE VALORACIÓN Virus Bacterias Endotoxinas Fungos Micotoxinas Protozoos Antíxenos CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Medidas de control dos axentes biolóxicos Actuacións sobre o axente biolóxico Limpeza

9 ÍNDICE Desinfección Esterilización Esterilización por calor Esterilización por radiacións Esterilización química Barreiras de contención Contención primaria Contención secundaria: sala de reactor edificio Cabinas de seguridade biolóxica Cabina de seguridade biolóxica tipo I Cabina de seguridade biolóxica tipo II Cabina de seguridade biolóxica tipo III Precaucións de carácter universal Equipos e prendas de protección individual Vacinación REQUIRIMENTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN Laboratorio de contención biolóxica 1. Laboratorio básico Laboratorio de contención biolóxica Laboratorio de contención biolóxica Laboratorio de contención biolóxica 4. Contención máxima CASOS PRÁCTICOS. EXEMPLOS DE MOSTRAXE DE AXENTES BIOLÓXICOS TOMADOS DA BIBLIOGRAFÍA Bacterias, fungos e endotoxinas en granxas de porcos Fungos en granxas de vacas Bacterias, fungos e endotoxinas en serradoiros de madeira Bacterias e fungos nunha planta de compostaxe Fungos e síndrome do edificio enfermo BIBLIOGRAFÍA ANEXO Real Decreto 664/ Orde do 25 de marzo de

10 INTRODUCIÓN

11 INTRODUCIÓN Os contaminantes biolóxicos son, xunto cos contaminantes químicos e os contaminantes físicos, os tres tipos de contaminantes obxecto de estudo da hixiene industrial. Non obstante, o seu peso dentro desta disciplina, que ten como obxectivo a prevención de enfermidades profesionais mediante o control da presenza dos seus axentes causantes no medio laboral, é moito menor. Dende os seus inicios, a hixiene industrial foi avanzando e incrementando os seus coñecementos sobre contaminantes físicos e químicos para lle dar resposta ao progreso industrial e á aparición no medio laboral de novos contaminantes, cuns efectos sobre a saúde humana que eran moitas veces descoñecidos. Dedicou os seus esforzos, fundamentalmente, a incrementar o coñecemento dos efectos producidos por estes contaminantes sobre os traballadores expostos, co fin de establecer uns niveis mínimos de exposición que, revisados periodicamente á luz das novas investigacións, garantisen a seguridade dos traballadores; así como ao estudo das medidas preventivas que permitisen reducir ao mínimo eses niveis de exposición. Hai unha serie de razóns que xustifican este diferente tratamento dos distintos contaminantes por parte da hixiene industrial e explica por que os contaminantes biolóxicos foron deixados en mans da medicina preventiva. Este abandono debeuse, entre outras causas, á gran variabilidade de factores que condicionan a presenza dos contaminantes biolóxicos. A súa supervivencia e actuación sobre o home no medio laboral: os contaminantes biolóxicos son seres vivos, capaces de se reproduciren; nunha mesma especie bacteriana existen cepas con distinto poder patoxénico; factores tales como a temperatura e a humidade poden condicionar a súa presenza no ambiente; os seus efectos dependen da susceptibilidade do hospedador (a súa inmunización previa, estados de inmunodepresión, etc.). Todos estas características non permiten establecer con claridade uns "valores máximos permitidos" xeneralizados e válidos para calquera que sexa a situación problema xerada, o que supón de por si unha dificultade engadida á difícil tarefa de avaliar a exposición a contaminantes biolóxicos. 15

12 INTRODUCIÓN Outra particularidade destacable dos contaminantes biolóxicos é que, a diferenza dos contaminantes físicos e químicos que producen os seus efectos unicamente sobre o traballador exposto, aqueles poden estender os seus efectos fóra do ambiente laboral. Por todo iso, os contaminantes biolóxicos consideráronse máis dende a perspectiva da saúde pública. Dende hai décadas, e nalgúns casos dende hai séculos, sábese da relación existente entre a exposición a determinados axentes infecciosos no medio laboral e a aparición de enfermidades concretas. Algunhas destas enfermidades atópanse recollidas no cadro de enfermidades profesionais do Real Decreto 1995/1978. Non obstante, o estudo dos riscos relacionados coa exposición a contaminantes biolóxicos no medio laboral hai que enfocalo, hoxe en día, dende unha perspectiva moito máis ampla que, ademais de cubrir aquelas actividades que viñan considerándose tradicionalmente de risco (traballadores que, por estar en contacto con animais ou os seus produtos, poden padecer zoonoses; persoal sanitario e de laboratorio exposto a contaxios), comprenda tamén as actividades que, sustentadas fundamentalmente no desenvolvemento das biotecnoloxías, están na orixe de novos riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos. A información de que dispoñemos actualmente permítenos afirmar, sen lugar a dúbidas, a relación existente entre a presenza de determinados axentes biolóxicos e/ou os seus produtos e a aparición duns determinados efectos sobre as persoas expostas. Así mesmo, son numerosos os estudos que, empregando metodoloxía moi diversa, tratan de cuantificar os axentes biolóxicos e as súas substancias no ambiente, e intentan relacionar as devanditas concentracións coa aparición dunha sintomatoloxía determinada. Non obstante, a falta de uniformidade nos métodos empregados impide comparar os diferentes estudos e chegar a conclusións definitivas. Algo se vai avanzando, e hoxe algúns autores dan valores indicativos para substancias ou grupos de axentes biolóxicos, pero isto é de difícil aplicación en tanto que os estudos realizados demostran que os resul- 16

13 INTRODUCIÓN tados entre laboratorios, para mostras tomadas no mesmo lugar e no mesmo tempo, poden diferir enormemente. Podemos dicir que os diversos valores indicativos e recomendacións dadas por distintos organismos internacionais (ACGIH, AIHA, OSHA, OMS ) para algúns grupos de axentes biolóxicos e os seus produtos orientan, máis que clarifican, á hora de valorar os resultados obtidos tras unha toma de mostra. Aínda haberán de pasar anos, nos que, en primeiro lugar, se deberán definir e consensuar claramente as técnicas de toma de mostra e os procedementos de análise que se deban utilizar en cada caso, para, posteriormente, mediante os necesarios estudos epidemiolóxicos e de investigación, establecer uns valores de referencia cos que poder comparar os niveis de exposición obtidos. Esta diferente visión dos riscos que supoñen a presenza de contaminantes biolóxicos no medio laboral plasmouse no terreo lexislativo na Unión Europea coa Directiva 90/679/CEE, sobre a protección dos traballadores contra os riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos durante o traballo, modificada pola Directiva 93/88/CEE, con posteriores adaptacións para ter en conta o progreso técnico (directivas 95/30/CE, 97/59/CE e 97/65/CE). A lexislación comunitaria en materia de prevención de riscos biolóxicos actualízase coa Directiva 2000/54/CE que derroga a Directiva 90/679/CEE, e as súas modificacións sucesivas. En España a transposición destas directivas realizouse mediante o Real Decreto 664/1997, do 12 de maio, que establece as disposicións mínimas aplicables ás actividades nas que os traballadores estean ou poidan estar expostos a axentes biolóxicos debido á natureza da súa actividade laboral, e é o punto de partida para a avaliación e planificación da prevención neste ámbito. Ademais, no que se refire ao risco por exposición a organismos modificados xeneticamente hai que ter presente a Directiva 90/219/CE, relativa á utilización confinada de microorganismos modificados xeneticamente, que foi modificada pola Directiva 98/81/CE, que teñen a súa transposición ao dereito español na Ley 9/2003, do 25 de abril, 17

14 INTRODUCIÓN pola que se establece o réxime xurídico da utilización confinada, liberación voluntaria e comercialización de organismos modificados xeneticamente. Tamén existe un Regulamento xeral para o desenvolvemento e execución da Lei 9/2003, que se aprobou mediante o Real decreto 178/2004, do 30 de xaneiro. Actualmente dispoñemos dunha normativa que nos obriga a lles prestar unha maior atención aos riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos, á vez que concreta uns criterios de actuación e serve de ferramenta para levar a cabo a avaliación de riscos e a planificación da acción preventiva. 18

15 OS AXENTES BIOLÓXICOS

16 OS AXENTES BIOLÓxICOS Dende o punto de vista da saúde laboral podemos definir os contaminantes biolóxicos como o conxunto de organismos vivos, partes destes ou substancias derivadas deles que son responsables da aparición de enfermidades de tipo infeccioso ou parasitario, ou que poden producir danos sobre a saúde dos traballadores como consecuencia dos seus efectos alérxicos ou tóxicos. A definición anterior comprende, pois, un grupo heteroxéneo de contaminantes que inclúe, xunto aos microorganismos patóxenos, causantes de enfermidades infecciosas, e aos parasitos, os microorganismos non patóxenos e as substancias derivadas dos seres vivos que teñen efectos alérxicos ou tóxicos no persoal exposto: pole, ácaros do po, restos de insectos, pelos, escamas de pel, feces e ouriños de animais, proteínas, endotoxinas, micotoxinas, (1 3)-ß-Dglucano, etc. Ata agora, e intencionadamente, falamos de contaminante biolóxico, aínda a sabendas de que o Real decreto 664/1997 se refire á protección dos traballadores contra os riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos durante o traballo. Non é conveniente, non obstante, asimilar os dous termos, pois, como veremos a continuación, non son plenamente coincidentes. O concepto de contaminante biolóxico é máis amplo que a de axente biolóxico. Mentres que o primeiro comprende os seres vivos, as súas partes ou substancias producidas por eles que lle poden ocasionar danos á saúde dos traballadores, os segundos están plenamente definidos no Real decreto 664/1997 como microorganismos, endoparasitos humanos e cultivos celulares. Así, dentro do concepto de axente biolóxico, e cinguíndonos á definición do real decreto, non entrarían substancias como o pole, os ácaros do po e as súas feces ou as substancias derivadas de animais (pelos, escamas de pel) responsables dun gran número de alerxias. Tampouco entrarían os ectoparasitos (piollos, chinches, etc.), por citar un par de exemplos. 21

17 OS AXENTES BIOLÓXICOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS POLE ÁCAROS PELOS INSECTOS ESCAMAS DE PEL... AXENTES BIOLÓXICOS MICROORGANISMOS ENDOPARASITOS CULTIVOS CELULARES AXENTES BIOLÓXICOS: CONCEPTO E CLASIFICACIÓN O Real decreto 664/1997, do 12 de maio, sobre a protección dos traballadores contra os riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos durante o traballo, define, no seu artigo 2, axente biolóxico como microorganismo, con inclusión dos xeneticamente modificados, cultivos celulares e endoparasitos humanos, susceptibles de orixinar calquera tipo de infección, alerxia ou toxicidade. Así mesmo, segundo o mesmo artigo, microorganismo é toda entidade microbiolóxica, celular ou non, capaz de se reproducir ou de transferir material xenético. E cultivo celular é o resultado do crecemento "in vitro" de células obtidas de organismos multicelulares. Así pois diferéncianse claramente os seguintes tipos de axentes biolóxicos: - microorganismos - endoparasitos humanos - cultivos celulares Como se pode apreciar, nesta definición non se inclúen explicitamente as substancias como as exotoxinas e endotoxinas bacterianas, as micotoxinas, os antibióticos, as proteínas, os encimas, etc. producidos polos axentes mencionados nesta, que poden causar reaccións inflamatorias do sistema respiratorio, alerxias e efectos sobre o sistema 22

18 OS AXENTES BIOLÓxICOS inmunolóxico. Non obstante, as devanditas substancias deben considerarse tamén obxecto deste real decreto, en tanto en canto a súa presenza no medio laboral é o resultado da presenza dos axentes biolóxicos e a súa concentración vai estar relacionada coa destes. O que non se inclúe, como xa se mencionou, son os produtos de animais (derivados dérmicos, soro ou ouriños) e vexetais (pole, po de madeira, etc.) que conteñen alérxenos que poden producir asma e outras enfermidades respiratorias. Isto non é óbice para que, dende o punto de vista da hixiene industrial, siga interesando a avaliación de riscos e a planificación da acción preventiva para controlar a presenza destes contaminantes no medio laboral. As medidas de control que cómpre aplicar son, en moitos casos, coincidentes coas que se poñen en práctica para os axentes biolóxicos. Antes de pasar a describir cada un dos tipos de axentes biolóxicos é conveniente lembrar a clasificación que, en función do risco de infección, establece o artigo 3 do Real decreto 664/1997. Para establecer esta clasificación tivéronse en conta aspectos que se refiren a como é a enfermidade que poden producir no home (probabilidade e gravidade), se supón un perigo para o traballador, se se pode propagar á colectividade e se existe ou non unha profilaxe ou un tratamento eficaz. Segundo o mencionado artigo, os axentes biolóxicos clasifícanse en catro grupos: Grupo 1: Grupo 2: aquel que resulta pouco probable que cause unha enfermidade no home. aquel que pode causar unha enfermidade no home e pode supoñer un perigo para os traballadores, aínda que é pouco probable que se propague á colectividade e existe xeralmente profilaxe ou tratamento eficaz. 23

19 OS AXENTES BIOLÓXICOS Grupo 3: Grupo 4: aquel que pode causar unha enfermidade grave no home e presenta un serio perigo para os traballadores, con risco de que se propague á colectividade e existe xeralmente unha profilaxe ou tratamento eficaz. aquel que causa unha enfermidade grave no home e supón un serio perigo para os traballadores, con moitas probabilidades de que se propague á colectividade e sen que exista xeralmente unha profilaxe ou tratamento eficaz. Clasificación dos axentes biolóxicos ENFERMIDADE PERIGO PARA PROPAGACIÓN PROFILAXE NO HOME TRABALLADORES COLECTIVIDADE TRATAMENTO GRUPO 1 pouco probable GRUPO 2 probable probable pouco probable existe GRUPO 3 probable/grave serio existe riesgo existe GRUPO 4 grave serio moitas probabilidades non existe No anexo II do Real decreto 664/97 preséntase unha lista de axentes biolóxicos clasificados nos grupos 2, 3 ou 4. Esta clasificación realizouse considerando os posibles efectos que os axentes poden ter sobre traballadores sans. Para elaborala non se tiveron en conta os efectos particulares que os devanditos axentes poidan producir sobre traballadores cunha sensibilidade que se vexa afectada por causas tales como patoloxías previas, medicación, trastornos inmunitarios, embarazo ou lactación. Circunstancias que si se han de ter moi presentes cando se realice a avaliación de riscos. Ao mirar esta clasificación pode chamar a atención que determinados axentes, como por exemplo Clostridium botulinum, causantes de enfermidades graves, e mesmo mortais, estean clasificados no grupo 2. Isto, que aparentemente parece incongruente, responde a que o grupo de 24

20 OS AXENTES BIOLÓxICOS clasificación se atribúe tendo en conta todas as características mencionadas, tamén a capacidade de se propagar á colectividade e a existencia de tratamento ou profilaxes eficaces. Con respecto á propagación á colectividade, o botulismo non é unha enfermidade infecciosa, senón que resulta dunha intoxicación por inxestión de alimentos contaminados coa toxina botulínica (1 µg de toxina é case unha dose letal para o home), máis que pola multiplicación de C. botulinum no tubo dixestivo. Trátase dun axente amplamente distribuído no chan, na lama de lagos e charcos e sobre a vexetación que, para ser cultivado, require unhas condicións moi especiais, entre elas a ausencia de osíxeno (é un anaerobio estrito). Estas condicións poden reunilas as conservas caseiras de verduras, nas que se produce a xerminación das esporas e a multiplicación vexetativa, con produción da toxina. Esta toxina é a que produce a enfermidade e as persoas afectadas serán aquelas que inxiren os alimentos crus contaminados sen que, evidentemente, se produzan contaxios posteriores. En canto ao tratamento, existen antitoxinas específicas para cada unha das toxinas que causan o botulismo humano, se ben, para que sexan eficaces, han de ser administradas antes de que a toxina alcance as terminacións nerviosas sensibles. A enfermidade pode, así mesmo, previrse por ebulición dos alimentos durante 10 minutos, pois deste modo destrúese a toxina botulínica. Do exposto anteriormente dedúcese que a clasificación dos axentes biolóxicos non se produce de modo arbitrario, senón que responde a un coñecemento complexo dos mecanismos de transmisión, dos efectos que produce e dos medios dispoñibles para combatelo: tratamento e profilaxe. Ademais, tamén hai que ter en conta que a non inclusión dun determinado axente na dita lista non significa que aquel deba ser implícita e inmediatamente clasificado no grupo 1, senón que, atendendo ás súas características infecciosas e tendo en conta as definicións de cada un dos grupos, se incluirá no que corresponda. Se, á hora de asignar un axente a un grupo, existise dubida entre dous grupos, 25

21 OS AXENTES BIOLÓXICOS asignarase ao grupo superior, garantindo así a maior seguridade para o traballador. Neste mesmo anexo II, aparecen xunto ao nome do axente biolóxico, a continuación do grupo de clasificación, unha serie de notas que dan información adicional sobre o axente. Estas notas son as seguintes: (A) posibles efectos alérxicos. É o caso de moitos dos fungos do anexo II que poden actuar como sensibilizantes das vías respiratorias, o que lles confire un risco adicional. Son exemplo destes fungos, algúns dos pertencentes aos xéneros Aspergillus, Penicillium, Microsporum ou Cryptococcus, entre outros. Tamén hai dous endoparasitos do xénero Ascaris que poden ocasionar alerxias. (D) A lista dos traballadores expostos ao axente debe conservarse durante máis de 10 anos despois da última exposición. Isto ha de ser así no caso daqueles axentes que presentan algunha das características mencionadas no artigo 9.3 do Real decreto 664/1997: poden provocar infeccións persistentes ou latentes, non son diagnosticables actualmente ata que se manifesta a enfermidade anos máis tarde, teñen períodos de incubación especialmente prolongados, dan lugar a enfermidades recorrentes durante un tempo prolongado ou poden ter secuelas importantes a longo prazo. Son todos axentes pertencentes ao grupo dos virus, por exemplo, os virus causantes da hepatite B, C ou D, o virus da SIDA, ou os axentes non clasificados asociados ás encefalopatías esponxiformes transmisibles. (T) Produción de toxinas. Destaca a facultade que teñen algunhas bacterias para producir toxinas, entre elas dúas do xénero Clostridium: C. botulinume e C. tetani; ademais de Corynebacterium diphtheriae e Shigella dysenteriae (tipo 1) 26

22 OS AXENTES BIOLÓxICOS (V) Vacina eficaz dispoñible. Indica a existencia dunha vacina efectiva que pode ser utilizada como ferramenta preventiva. Son moitas as vacinas existentes. O empresario ofreceralles aos traballadores non inmunizados as vacinas contra os axentes biolóxicos aos que estean ou poidan estar expostos. (*) Normalmente non infeccioso a través do aire. Esta anotación indica que os axentes biolóxicos aos que se aplica, todos eles do grupo 3, non se transmiten por vía aérea. Tal circunstancia debe terse en conta ao realizar a avaliación de riscos, ao planificar a acción preventiva e ao seleccionar as medidas de contención. Exemplos: Axente clasificación notas Clostridium tetani 2 T.V. Virus da hepatite C 3 (*) D. Aspergillus fumigatus 2 A. MICROORGANISMOS Enténdese por microorganismo toda entidade microbiolóxica, celular ou non, capaz de se reproducir ou de transferir material xenético. Dentro dos microorganismos hai que distinguir entre os que non son células e aqueloutros que presentan unha estrutura celular. No primeiro grupo inclúense os virus e os denominados axentes "non clasificados". O segundo grupo comprende os protistas ou moneras. Así mesmo, dentro destes últimos, hai que diferenciar, en función da complexidade celular, entre procariotas, que comprende as bacterias, clamidias, rickettssias e micoplasmas, e eucariotas, dos que forman parte os fungos, a maioría das algas e os protozoos. 27

23 OS AXENTES BIOLÓXICOS Clasificación dos microorganismos NON CELULAR VIRUS Axentes non clasificados Estrutura procariota: bacterias rickettssias clamidias micoplasmas CELULAR Estrutura eucariota: fungos protozoos algas Virus De entre todos os microorganismos, os virus son os máis sinxelos. A medio camiño entre os seres vivos e a materia inanimada, atópanse constituídos por un ácido nucleico (ADN ou ARN de cadea sinxela ou dobre) que porta a información xenética; e unha cápsula proteica ou cápsida e, en ocasións, unha envoltura membranosa, que desempeñan unha función de protección dese material xenético. Carecen de metabolismo, xa que non posúen encimas. Para a súa reprodución requiren a materia, a enerxía e o sistema encimático doutro ser vivo. Son, polo tanto, parasitos intracelulares obrigados. Por iso, os virus son definidos como pequenas estruturas encargadas de transportar un ácido nucleico entre unha célula hospedadora e outra célula hospedadora. O seu tamaño non excede dos Å (0'25 μm). Os virus máis sinxelos, os viroides, constan unicamente dun ácido nucleico. Os máis complexos posúen estruturas protectoras de natureza proteica e, ás veces, unha cuberta membranosa adicional que o protexe do medio e serve de vehículo para a súa transmisión dende unha célula hospedadora a outra. Xeralmente a cápsida está constituída pola repetición dun só tipo de proteína ou capsómero. A unión destas orixina tres tipos de cápsidas: icosaédrica, helicoidal e complexa (figura 1). 28

24 OS AXENTES BIOLÓxICOS Icosaédrica. - O icosaedro é unha forma poliédrica de 12 vértices, 20 caras triangulares e 30 arestas. Un exemplo podería ser un picornavirus como o da poliomielite. A cápsida está composta por 32 capsómeros cunha posible disposición que se amosa na figura 1. Helicoidal. - Neste tipo de cápsida, os capsómeros adoptan unha ordenación helicoidal, formando unha estrutura tubular en cuxo interior se sitúa o ácido nucleico. A súa anchura é de 175 Å e a súa lonxitude máxima de Å, como, por exemplo, o virus da rabia. Complexa. - Este tipo de cápsida posúena algúns virus especializados en parasitar bacterias, polo que recibe o nome de bacteriófagos. Esta cápsida pódese delimitar en dúas partes: cabeza, de tipo icosaédrica e que contén o ácido nucleico; e cola, adaptada para a inxección do ácido nucleico no interior da bacteria. Na base da cola poden existir encimas e ATP, que teñen a función de destruír a parede bacteriana. Envoltura. - Un grupo de virus, como os que producen a rabia, a hepatite, a gripe e a varíola, posúen unha envoltura de tipo membranoso arredor da cápsida. Esta envoltura adoita ser proteica, pero algúns virus, por exemplo, o da gripe, posúen unha envoltura similar á membrana unitaria, xeralmente procedente das células hospedadoras ás que parasita. 29

25 OS AXENTES BIOLÓXICOS Figura 1.- Morfoloxía vírica TIPOS DE CÁPSIDE cabeza eixo tubular Helicoidal vaíña zona caudal placa basal fibra caudal Complexa (bacteriófagos) Icosaédrica (virus da poliomielite) ENVOLTURA envolta proteica cápside proteínas da membrana envolta membranosa envolta proteica cápside ARN asociado ao nucleoproteínas Virus da hepatite Virus da gripe 30

26 OS AXENTES BIOLÓxICOS Os virus carecen de funcións de nutrición, xa que non requiren enerxía para desenvolver ningunha actividade nin para crecer. Así mesmo, carecen de funcións de relación, pois o contacto cunha célula hospedadora é totalmente fortuíto. Cada clase de virus é capaz de infectar soamente a certas especies de células hospedadoras. Esta especificidade depende tanto das propiedades da capa externa do virión coma dos receptores específicos situados na superficie celular. Unicamente se estudan as funcións de reprodución ou, o que é o mesmo, o seu ciclo vital (figura 2). O ciclo de multiplicación vírico require unha célula hospedadora de onde obter materia e enerxía para sintetizar novos ácidos nucleicos e capsómeros. Posúe seis fases: 1) fixación ou absorción, 2) penetración, 3) replicación do ácido nucleico, 4) síntese de capsómeros, 5) ensamblaxe dos novos virus e 6) liberación. Na fase de fixación ou absorción os virus establecen contacto coa célula hospedadora, fixándose a esta mediante, primeiro, un proceso de reacción química entre as proteínas externas dos dous e, logo, mediante procesos mecánicos. O virus da gripe, por exemplo, establece enlaces químicos entre as proteínas da membrana e da envoltura. Unha vez fixado o virus, este induce unha fagocitose por parte da célula que, deste modo, o introduce no interior dun fagosoma. A fixación é seguida pola fase de penetración. O virus pasa ao interior da célula hospedadora onde é decapsulado o ácido nucleico. O ácido nucleico pode permanecer no citoplasma celular, como por exemplo, nos Poxvirus, ou pode penetrar ata o núcleo da célula como acontece cos Herpesvirus e Adenovirus, parece ser que este podería ser tamén o caso do virus da gripe. Durante a fase de eclipse, que recibe este nome debido a que non se observan virus no interior da célula, sintetízase gran cantidade de ARN a partir dos ácidos nucleicos víricos. Este ARN serve de base para sintetizar encimas que impiden 31

27 OS AXENTES BIOLÓXICOS o normal funcionamento da célula. Posteriormente prodúcese a replicación dos ácidos nucleicos víricos e sintetízanse os capsómeros. A multiplicación vírica pode producirse, dependendo da familia vírica, no citoplasma ou no núcleo da célula hospedadora. Na fase de ensamblaxe, os capsómeros reúnense formando a cápsida. Simultaneamente, ou con posterioridade, o ácido nucleico prégase e rodéase dos capsómeros. No virus da gripe os capsómeros únense paulatinamente a medida que o ácido nucleico se prega. Posteriormente este diríxese cara á membrana. Na fase de liberación, os novos virus saen ao exterior, xa sexa mediante a destrución da célula hospedadora (lise) por acción dun encima (endolisina), ou mediante a formación de vesículas que, en ocasións, quedan rodeadas por fragmentos da membrana da célula hospedadora. Neste caso non é necesaria a destrución celular, que, non obstante, se producirá algo máis tarde, debido ás importantes alteracións funcionais que o virus lle causou. Algúns virus, ao infectar unha célula hospedadora, non a destrúen, o que constituiría un ciclo lítico, senón que o material xenético vírico se integra no ADN celular. Estes virus son denominados atenuados o prófagos, e a célula receptora lisóxena. O ADN vírico ou prófago pode permanecer en forma latente ata que un estímulo induza a súa separación, iniciándose entón un ciclo lítico típico. Neste tipo de infeccións os efectos pódense manifestar de forma recorrente. 32

28 OS AXENTES BIOLÓxICOS Figura 2.- Ciclo de multiplicación vírica ADSORCIÓN PENETRACIÓN ECLIPSE LIBERACIÓN ENSAMBLAXE Os virus clasifícanse en diferentes grupos tendo en conta a súa estrutura e o tipo de ácido nucleico que os constitúen. Dentro dos virus atopamos os únicos axentes que no anexo II do Real decreto 64/1997 se clasifican no grupo 4, é dicir, son responsables de causar enfermidades graves no home e un serio perigo para os traballadores, poden propagarse á colectividade e non existe xeralmente unha profilaxe ou tratamento eficaz. Pertencen a este grupo 4 virus que, nos casos mortais, desenvolven miocardite, pneumonía, encefalopatía e lesións hemorráxicas. A continuación coméntanse algunhas 33

29 OS AXENTES BIOLÓXICOS das características máis salientables destes virus. O virus Junin e virus Lassa, dentro dos Arenaviridae, teñen nos morcegos e roedores os seus principais reservorios, polo que o control destes serve para limitar a súa transmisión ao home, aínda que o virus Lassa é altamente contaxioso. O único lugar coñecido de infeccións naturais é Nixeria. O virus da febre hemorráxica de Crimea/Congo, un Nairovirus, utiliza as carrachas como vectores. O virus Ébola e o virus de Marburg afectan primates non humanos fundamentalmente, non obstante, os casos en humanos son extremadamente graves e frecuentemente mortais. Debe ter un coidado especial o persoal de investigación que traballa con estes virus, e, particularmente, aqueles que traballan con cultivos celulares obtidos a partir de células de simios. En 1967 apareceu en Marburg e Frankfurt (Alemaña) e en Iugoslavia un proceso febril que afectaba persoal de laboratorio que manipulaba tecidos e cultivos celulares de mono verde africano. Dos 31 casos que aconteceron, incluídos as infeccións no persoal sanitario que atendeu a estes pacientes, producíronse 7 mortes. Aínda que os virus mencionados arriba non son propios da nosa zona xeográfica, hai que considerar o risco latente que supón para a súa propagación a velocidade actual dos transportes que incrementa os desprazamentos e a mobilidade de poboación entre os diferentes lugares do mundo. Tamén os virus causantes da varíola se encadran no grupo 4. Esta enfermidade foi declarada erradicada en 1980 e o risco de infección só existe para o persoal que utiliza na súa investigación as cepas deste virus que aínda se conservan. Dende 1983, só Estados Unidos e Rusia recoñecían telo, pero sospéitase que outros países teñen cepas do virus, que podería ser colocado en cabezas de mísiles intercontinentais. Existe unha vacina eficaz contra este virus, non obstante, ao estar erradicado, a vacinación sistemática carece de sentido. De todos os xeitos, coa ameaza de guerra biolóxica, fabricáronse enormes cantidades de vacina por se fose necesaria para facer fronte a un eventual ataque. Estímase 34

30 OS AXENTES BIOLÓxICOS que a mortalidade en vacinacións masivas é de 1-2 mortes por cada millón de vacinados. Ademais dos virus vistos, que pertencen ao grupo 4, son moitos os que pertencen ao grupo 3. Estes, ao igual que os anteriores, producen enfermidades graves no home e supoñen un serio perigo para os traballadores, con risco de propagación á colectividade, aínda que neste caso si existe unha profilaxe ou tratamento eficaz. Pertencen a este grupo virus tan coñecidos como os causantes da hepatite B e da hepatite C (o virus causante da hepatite A pertence ao grupo 2), o virus de inmunodeficiencia humana ou o virus da rabia. Tamén os Flavivirus e os Alphavirus, causantes de encefalites graves, pertencen ao grupo 3. Destes hai que destacar que utilizan artrópodos como vectores e hospedadores intermediarios. Outro grupo importante de axentes biolóxicos incluídos no grupo 3 son os denominados axentes non clasificados asociados a encefalopatías esponxiformes transmisibles (TSE) que ocasionan enfermidades como a de Creutzfeldt- Jakob, a encefalopatía esponxiforme bovina (BSE) e outras TSE de orixe animal afíns. Destes axentes non se coñece a súa natureza exacta, pero o que si se sabe é que non se trata de virus nin de bacterias. A enfermidade ponse de manifesto pola presenza nos tecidos contaminados dunha proteína anormal. Estas partículas proteicas infecciosas coñécense como prións. Os axentes non clasificados asociados ás TSE presentan, xunto ao grupo de clasificación 3, a notación D, debido ao seu longo período de latencia. Actualmente non existen métodos que permitan diagnosticar a infección antes de que se manifeste a enfermidade. Aquela infírese logo da aparición dos signos clínicos e confírmase pola presenza dos prións nos tecidos contaminados. Para os traballos no laboratorio recoméndanse medidas de contención de nivel 3 (*) como medida de protección, malia non existir probas concluíntes da infección humana causada polos axentes responsables da TSE nos animais. A continuación imos ver as características dalgúns dos axentes víricos máis comúns. Na táboa 1 pode verse unha 35

31 OS AXENTES BIOLÓXICOS clasificación dos principais virus que afectan o home polas súas características patoxénicas. Virus da hepatite B (VHB).- Tamén se coñece como hepatite sérica para diferenciala da hepatite A ou hepatite infecciosa. A transmisión da primeira prodúcese fundamentalmente pola inxección de sangue ou produtos infectados, mentres que a hepatite A se transmite por vía intestinaloral. Non obstante, as diferenzas de transmisión non son absolutas, posto que o virus da hepatite A pode producir tamén enfermidade cando é inoculado por vía parenteral e, experimentalmente, o virus da hepatite B puido transmitirse por vía oral. Hai que sinalar que, a pesar de que os dous virus producen hepatite, son morfoloxicamente diferentes. O virus causante da hepatite A é un virus de pequeno tamaño carente de envoltura que pertence aos Picornavirus; e o virus que produce a hepatite B é un virus encapsular que, xunto co que ocasiona a hepatite D, forman parte da familia dos Hepadnavirus. O VHB provoca unha enfermidade grave, que mesmo pode ser mortal. Presenta un período prolongado de incubación, de aí a obriga de conservar a lista dos traballadores expostos durante máis de dez anos despois da última exposición. Afecta fundamentalmente profesionais sanitarios: médicos, dentistas, enfermeiras, persoal de sala de hospital, frecuentemente expostos a portadores crónicos non coñecidos, e persoal de laboratorio e técnicos que procesan produtos hemáticos humanos. Tamén o virus da hepatite D (delta) pertence ao grupo 3. Para que manifeste a súa patoxenicidade, a infección polo virus da hepatite D ha de producirse de xeito simultáneo ou secundario á provocada polo virus da hepatite B. A vacinación contra o virus da hepatite B protexerá, pois, os traballadores non infectados polo virus da hepatite B, contra o virus da hepatite D. A vía de transmisión fundamental é a vía parenteral e os profesionais que corren un maior risco de infección son os mesmos que para o virus da hepatite B. 36

32 OS AXENTES BIOLÓxICOS Tamén debe conservarse a lista dos traballadores expostos por un período de tempo superior a dez anos. O virus da hepatite C ten, ao igual que o VHB, a vía parenteral como vía fundamental de penetración. O persoal exposto a este risco é, polo tanto, o mesmo que no caso da hepatite B. Tamén debe conservarse a lista de traballadores expostos durante máis de dez anos despois da última exposición. Neste caso non existe vacina eficaz. A infeccións crónicas polo virus da hepatite B e o virus da hepatite C están consideradas pola IARC como carcinoxénico para humanos, e como tales inclúeos no grupo 1 na súa clasificación de carcinoxenicidade (IARC,1994). O virus da hepatite A (VHA) presenta unha menor virulencia que os anteriores, causando unha enfermidade xeralmente leve ou imperceptible, pertence ao grupo 2. Polo seu modo de transmisión, vía oral-intestinal, e por presentar certa estabilidade, resistente mesmo a desinfectantes tales como o cloro nas concentracións habituais na auga, supón un risco real para, ademais do persoal sanitario e de laboratorios, aquel persoal que traballa en estacións depuradoras de augas residuais. O virus da inmunodeficiencia humana (VIH-SIDA) é un virus que, como o seu nome indica, afecta o sistema inmunitario. Illouse do sangue e outros líquidos corporais: seme, saliva, bágoas, etc. e as súas vías principais de transmisión, dende o punto de vista laboral, son a inoculación e, en menor medida, o contacto co sangue e hemoderivados infectados co virus. Deben evitarse as picadas con agullas e a exposición de lesións abertas ao sangue do paciente. Así mesmo, debe terse especial coidado ao manexar material punzante e cortante, depositándoo despois do seu uso en recipientes ríxidos. Os avances terapéuticos permitiron superar a idea de que a SIDA é unha enfermidade irremediablemente mortal. Actualmente, polo menos nos países desenvolvidos, considérase máis ben unha enfermidade crónica, pois unha axeitada medicación prolonga a vida dos 37

33 OS AXENTES BIOLÓXICOS enfermos que gozan, ademais, dunha razoable calidade de vida. Os Herpesvirus son un grupo de virus clasificados, case todos eles, dentro do grupo 2, responsables dun número importante de enfermidades amplamente difundidas: o herpes simple, tipos I e II; o Herpesvirus simiae, pertencente ao grupo 3; o virus varíola-zoster; o virus de Epstein-Barr e o citomegalovirus. O virus do herpes simple caracterízase pola súa tendencia a persistir en estado latente no home e a activarse a intervalos regulares. A infección inicial prodúcese a través dunha erosión das mucosas ou da pel, onde se produce a multiplicación do virus. Cando a infección inicial cede, o virus persiste latente nos ganglios nerviosos próximos ao lugar da infección inicial. O virus do herpes simple ten dúas variantes inmunolóxicas principais con características epidemiolóxicas e distribución corporal diferenciadas. O virus do tipo I está asociado de forma primaria con lesións orais e oculares, e transmítese polas secrecións orais e respiratorias. O virus do tipo II está asociado de forma primaria con lesións anais e xenitais e transmítese por contacto sexual. Non obstante, este patrón pode verse alterado polas prácticas sexuais. Así, en ocasións, illouse o virus tipo II en lesións orais e o virus tipo I en lesións xenitais. O home é o único hospedador e fonte de infección coñecida do virus, polo que o mecanismo habitual de transmisión é o contacto directo de persoa a persoa. Tamén pode transmitirse a través dos utensilios utilizados para a alimentación. Dentro dos Herpesvirus, o Herpesvirus simiae (virus B) é o máis virulento. O virus B infecta máis do 70% dos macacos adultos cativos. Se ben no macaco produce infeccións latentes, cando infecta o home é case sempre mortal. A manipulación de monos e o uso de células renais de monos na fabricación de vacinas aumentou a transmisión deste virus aos humanos. Xeralmente, as infeccións polo virus B prodúcense como consecuencia de mordedelas ou rabuñaduras dos macacos, picadas con agullas usadas en zonas próximas ás membranas mucosas dos macacos ou ao sistema nervio- 38

34 OS AXENTES BIOLÓxICOS so central, ou por contacto con produtos infecciosos destes. Non obstante, tamén se notificou un caso de infección mortal a partir dunha exposición ocular á secreción dun macaco con resultado final de morte (DHHS-NIOSH Publication Nº , 1999). O herpes varíola-zoster é o máis contaxioso entre os herpes, causando enfermidade benigna. Afecta fundamentalmente os nenos, e son poucos os adultos susceptibles, aínda que nestes a enfermidade pode ocasionar encefalite e pneumonía. O citomegalovirus tamén adoita causar enfermidade leve, pero o seu principal risco reside nos efectos sobre o feto nos primeiros meses de embarazo. Hai que lles prestar unha atención especial ás mulleres embarazadas como grupo de risco. O virus da rubéola, pertencente ao grupo dos Togaviridae, causa unha enfermidade leve pero que adquire unha importancia especial no caso das mulleres embarazadas, pois, durante os tres primeiros meses de xestación, pode producir a morte do feto ou graves malformacións conxénitas. Transmítese con facilidade por vía respiratoria. O grupo Picornaviridae comprende, entre outros, os poliovirus, virus coxsackie e virus echo que posúen características epidemiolóxicas similares, así como parecidas características físicas, químicas e biolóxicas, e comparten a propiedade de infectar o tubo dixestivo do home. A súa vía de transmisión é, polo tanto, fecal-oral. A poliomielite é unha enfermidade de distribución universal, tanto máis grave canto maior é a idade da persoa afectada. O virus pode, dende a mucosa orofarínxea e intestinal onde ten lugar a multiplicación primaria, diseminarse a través do sistema linfático e o sangue ata o sistema nervioso central onde pode ocasionar unha enfermidade paralizante grave. O home é o único hospedador natural coñecido dos poliovirus. A propagación realízase por contacto de persoa a persoa ou a través de auga ou alimentos contaminados. 39

35 OS AXENTES BIOLÓXICOS TÁBOA 1. Clasificación dos virus polas súas características patoxénicas no home Clasif. segundo os órganos que afectan Virus respiratorios Virus entéricos Virus neurotropos Virus dermotropos Virus específicos Gripe A, B e C Parainfluenza Respiratorio sincitial Sarampelo Parotidite Adenovirus Rinovirus Coxsackievirus (algúns) Echovirus Reovirus Coriomeninxite linfocitaria Coronavirus Poliovirus Coxsackievirus Echovirus Rotavirus (reovirus) Hepatite A, B e C Poliovirus Coxsackievirus Echovirus Virus da rabia Parotidite Arbovirus Herpe simple Virus B Varíola herpes zoster Coriomeninxite linfocitaria Poxvirus Sarampelo Varíola herpes zoster Coxsackievirus Echovirus Herpe simple Rubéola Espulla humana (papilomavirus) Virus do músculo contaxioso Porta de entrada Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato gastrointestinal Aparato gastrointestinal Aparato gastrointestinal Aparato gastrointestinal Aparato gastrointestinal e sangue Aparato gastrointestinal Aparato gastrointestinal Aparato gastrointestinal Pel e sangre Aparato respiratorio Sangue Aparato respiratorio; xenitais Aparato respiratorio; sangue Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato respiratorio Aparato gastrointestinal Aparato gastrointestinal Pel Aparato respiratorio Pel Dulbecco, R. e Ginsberg, H.S. (1984b) Pel Outros órganos afectos Cerebro, pel SNC, testículos, ovarios, páncreas SNC SNC, pel? SNC Músculos, SNC SNC, piel SNC, piel Fígado Vías respiratorias superiores Vías respiratorias superiores Vías respiratorias superiores Testículos, ovarios, páncreas Pel Aparato respiratorio Pel, córnea Aparato respiratorio Aparato respiratorio, vísceras, SNC Pulmón, cerebro SNC, córnea Vías respiratorias superiores SNC, aparato gastrointestinal Ganglios periféricos, córnea Aparato respiratorio 40

36 OS AXENTES BIOLÓxICOS Bacterias Son organismos máis complexos que os virus, o que lles permite vivir nun medio axeitado sen necesidade de pasar por un hospedador intermediario. Cómpre ter en conta que un bo número delas son patóxenas para o home. Son organismos unicelulares procariotas*, representados por unhas especies. O seu tamaño oscila entre 1'3 e 10 μm do Bacillus anthracis e 0'7-1'2 μm do Staphylococcus aureus. *As células procariotas diferéncianse das eucarióticas en que carecen dunha membrana ou envoltura nuclear que separa o ADN do resto da célula. A estrutura das células procariotas é moi sinxela, carecendo dalgúns dos orgánulos presentes nas células eucarióticas. Esta sinxeleza organizativa vai acompañada dunha redución no tamaño. As unidades empregadas en microscopía para definir as dimensións destes organismos son o micrómetro (μm) e o angström (Å), e as súas equivalencias son: 1mm = 10 3 μm = 10 6 nm = 10 7 Å Morfología bacteriana As bacterias posúen catro tipos morfolóxicos, adaptados ás características alimenticias e do medio no que viven: bacilo (forma alongada), espirilo (espiral), vibrio (semellante a unha coma) e coco (redondeada). Algunhas bacterias presentan agrupacións dos individuos debido a que, unha vez producida a división, a cápsula bacteriana mantén unidas as bacterias producidas. Os bacilos adoitan presentar cadeas lineais, xa que a súa división ten lugar nunha soa dirección. Os coco, atendendo ás posibles direccións de división, presentan varios tipos de agrupacións. 41

37 OS AXENTES BIOLÓXICOS A organización dunha bacteria é moi simple. Estes son os seus principais elementos estruturais (figura 3): A cápsula bacteriana é unha capa xelatinosa que aparece en case todos os grupos bacterianos patóxenos. Estruturalmente, esta cuberta é abundante en glícidos de gran tamaño. A función da cápsula bacteriana é dobre. Por unha parte, ocúpase da regulación dos procesos de intercambio de auga, ións e substancias nutritivas, ademais de servir como almacén externo de elementos nutritivos. En segundo lugar, serve como defensa fronte a anticorpos, bacteriófagos e células fagocíticas. Tamén protexe a bacteria de desecamentos do medio, xa que esta envoltura contén gran cantidade de auga. A cápsula adoita desempeñar un importante papel na patoxenicidade. A cápsula permite a formación de agrupacións ou colonias de bacterias. A parede bacteriana é unha envoltura ríxida e forte que lles dá forma ás células bacterianas. Existen dous tipos de parede: o denominado Gram positivo e o tipo Gram negativo. A parede mantén a forma da bacteria fronte a variacións de presión osmótica. Tamén actúa como unha membrana semipermeable, regulando o paso de ións. Esta envoltura, unha vez formada, é resistente á acción dalgúns antibióticos que actúan sobre os encimas que regulan a formación da parede. A destrución da parede deixa inerme a bacteria. A parede da célula bacteriana posúe un interese especial dende o punto de vista médico pola gran cantidade de antíxenos de superficie que posúen, e que interactuan cos mecanismos de defensa do hospedador. Ademais, no caso das bacterias gram negativas, esta parede bacteriana está constituída por complexos de proteínas e lipopolisacáridos que teñen, estes últimos, gran relevancia dende o punto de vista da hixiene industrial polos seus efectos tóxicos, e son denominados endotoxinas. As endotoxinas son liberadas ao medio despois da lise das células bacterianas e aparecen no chan, na auga ou no aire. Son responsables de numerosas afeccións do aparato respiratorio (causan inflamación e incremento da resposta inmune aos alérxenos) no persoal que traballa no interior dos edificios. 42

38 OS AXENTES BIOLÓxICOS A membrana citoplásmica é unha envoltura que rodea o citoplasma bacteriano. É, esencialmente, igual que a que aparece nas células eucarióticas, variando unicamente algunhas das moléculas que a compoñen. As funcións da membrana citoplásmica bacteriana son, principalmente, limitar a célula (a bacteria neste caso) e regular o paso de substancias nutritivas. Unha particularidade que presentan as bacterias é a existencia duns repregamentos internos que reciben o nome de mesosomas, que incrementan a superficie da membrana, e serven para suxeitar o cromosoma bacteriano. Ademais posúen unha gran cantidade de encimas necesarios para a duplicación do ADN bacteriano, a respiración, o crecemento da membrana citoplásmica, a fotosíntese, e a asimilación de N 2, NON 3 - e NON 2 -. Delimitado pola membrana plasmática bacteriana atópase o hialoplasma, e, inmerso neste, atópanse os ribosomas que, en número duns , están libres no citoplasma e actúan na síntese de proteínas, e as inclusións que son gránulos de reserva de diversos tipos de substancias que a bacteria sintetiza en épocas de abundancia de alimentos, ou ben de residuos do seu metabolismo. 43

39 OS AXENTES BIOLÓXICOS Figura 3.- Morfoloxía bacteriana BACTERIA CON CÁPSULA PAREDE BACTERIANA O ADN bacteriano está constituído por unha soa molécula circular de tipo bicatenario moi pregada e que adoita estar unida aos mesosomas. Esta molécula é moi longa en comparación co tamaño da bacteria. Así, a Escherichia coli, de 2 µm, posúe un ADN de µm. A súa función é manter e conservar a información xenética e dirixir o funcionamento da bacteria. As bacterias presentan, ademais, outras estruturas como son: os flaxelos, cunha lonxitude que é varias veces a da bacteria e o seu número moi variable, proporciónanlles o medio de locomoción ás bacterias que os posúen; os pelos, tamén denominados pili ou fimbria, son unhas estruturas ocas, tubulares, moi numerosas que rodean uniformemente a bacteria, ás que se lles supoñen funcións de fixación a 44

40 OS AXENTES BIOLÓxICOS un substrato, de intercambio de moléculas co exterior e de intercambio de información xenética con outra bacteria. Fisioloxía bacteriana As bacterias, ao igual que calquera ser vivo, desenvolven funcións de nutrición, relación e reprodución. En canto ás funcións de nutrición, as bacterias forman un grupo moi heteroxéneo, xa que as súas diferentes especies poden realizar todos os tipos de metabolismo existentes. Algunhas especies mesmo poden posuír dous tipos de metabolismo diferentes que utilizan facultativamente, dependendo da abundancia nutritiva do medio. Segundo a fonte de enerxía as bacterias poden ser: fototrofas (enerxía lumínica), quimiotrofas (oxidación de substancias inorgánicas) e quimiorganotrofas (oxidación de substancias orgánicas). Segundo a fonte de carbono, son autotrofas (CO 2 ) e heterotrofas (carbono de moléculas orgánicas). Polo que se refire ás funcións de relación, case todas as bacterias poden desprazarse mediante reptación, movementos de contracción e dilatación e movemento flaxelar; este último permítelles alcanzar, en medios acuosos, velocidades de ata 20 cm./hora. Comprobáronse respostas fronte a estímulos luminosos (fototactismo), en bacterias fotosintéticas, e a estímulos químicos (quimiotactismo). Unha das respostas mellor coñecidas fronte ás variacións do medio é a formación de esporas ou formas de resistencia (figura 4). As bacterias, fronte a condicións adversas ou de carencia de alimento, desenvolven procesos nos cales protexen o seu ADN e entran en períodos de metabolismo reducido. A máis típica é a endospora, que soporta condicións de sequidade, temperaturas de ata 80º C, e a acción de axentes químicos e radiacións durante longos períodos de tempo, ás veces, de varios séculos. Ao aparecer de novo condicións propicias xermina e dá lugar a unha nova bacteria con todas as súas funcións vitais. Son exemplos de bacterias produtoras de esporas as causantes da nacida ou do tétano. 45

41 OS AXENTES BIOLÓXICOS As esporas de Bacillus anthracis, que poden destruírse por ebulición durante dez minutos e por calor seca a 140º C durante tres horas, persisten durante moitos anos na terra seca e poden permanecer viables durante varios meses nos coiros de animais. A infección coa espora pode producirse por contacto ou por inhalación, esta última pode ser mortal. Por último, no que se refire ás funcións de reprodución bacteriana, esta realízase mediante unha bipartición, á que precede unha duplicación do ADN e unha separación das dúas moléculas (figura 5). As bacterias posúen uns mecanismos, definidos como parasexuais, mediante os cales intercambian información xenética con outras bacterias, sexan ou non da mesma especie. Estes mecanismos explican a variabilidade que poden presentar algunhas bacterias ao habitar xunto a outras distintas. Un exemplo deste proceso é a resistencia a antibióticos que presentan certas bacterias patóxenas ao convivir no intestino con bacterias simbiontes que resisten ben a acción destes produtos farmacéuticos. 46

42 OS AXENTES BIOLÓxICOS Figura 4.- Fisioloxía bacteriana: ciclo de esporulación A célula bacteriana (a), inicia a esporulación cunha condensación do ADN nun extremo da célula e o crecemento dos mesosomas cara ao interior do citoplasma (b) ata que se unen, separando o ADN do resto do citoplasma (c). A membrana continúa o seu crecemento ata rodear de novo o ADN (d) e forma a endospora que se atopa protexida por unha resistente cuberta (e). A endospora pode liberarse e formar unha exospora (f). 47

43 OS AXENTES BIOLÓXICOS Figura 5.- Fisioloxía bacteriana: reprodución por bipartición A reprodución da célula bacteriana (a) comeza coa duplicación do ADN (b). O novo ADN únese a outro mesosoma (c). Estes mesosomas sepáranse arrastrando as réplicas de ADN cara aos extremos da célula, ao tempo que uns novos mesosomas crecen para dar lugar a dúas células para formar unha parede (d) que remata por dividir o citoplasma, dando lugar a dúas células fillas iguais entre si, de menor tamaño que a célula nai (e). 48

44 OS AXENTES BIOLÓxICOS Seguidamente imos deternos nas características dalgunhas das bacterias que merecen unha especial atención dende o punto de vista da hixiene industrial. Bacillus anthracis é un axente que afecta primariamente os animais, non obstante, pode afectar granxeiros, veterinarios ou traballadores en contacto con animais infectados, así como a aqueles outros traballadores que manipulen las e coiros. No home esta enfermidade coñécese como nacida ou ántrax. A infección prodúcese cando os traballadores entran en contacto cos animais, as súas peles ou as súas excrecións (ántrax cutáneo). Aínda que as formas máis graves da enfermidade, ántrax pulmonar, que pode ser letal, xorden como consecuencia da inhalación de esporas. As esporas de Bacillus anthracis poden permanecer viables durante meses e mesmo anos no pelo e na pel dos animais infectados, e na terra seca. No ántrax pulmonar a quimioterapia adoita ser ineficaz porque a enfermidade raramente pode diagnosticarse antes de que apareza a bacteriemia. A virulencia deste axente está ligada á produción dunha toxina. No anexo II do Real decreto 664/1997 está clasificado como un axente do grupo 3. O xénero Clostridium está formado por un grupo de bacilos esporulados anaerobios. O seu hábitat natural é o chan e os tubos intestinais dos animais e do home. Causan enfermidades como o botulismo (C. botulinum), o tétano (C. tetani) e a gangrena gasosa (C. perfringens). Estas tres especies correspondentes ao xénero Clostridium clasifícanse no nivel 2 no anexo II do Real decreto 664/1997, ademais as especies C. botulinum e C. tetani teñen a notación "T", indicadora da produción de toxinas (táboa 4), e esta última especie, ademais, a notación "V", que sinala que existe vacina eficaz. C. tetani é un anaerobio estrito cuxa patoxenicidade depende dunha potente neurotoxina que se libera cando as esporas xerminan despois de penetrar nas feridas. As esporas de C. tetani atópanse amplamente diseminadas polo chan. 49

45 OS AXENTES BIOLÓXICOS C. botulinum áchase amplamente distribuído no chan, lamas de lagos e charcas e vexetación, e aparece, polo tanto, nos contidos intestinais dos mamíferos. A produción da toxina está asociada coa xerminación das esporas e co crecemento de células vexetativas. As esporas de C. botulinum son relativamente termorresistentes e é necesaria a esterilización a presión para asegurar a súa destrución. A toxina botulínica é relativamente termolábil, é inactivada en dez minutos a 100º C; polo tanto, a ebulición inmediatamente antes da inxestión de conservas caseiras de verduras ou peixe sometido a tratamento industrial confire seguridade. Debe poñerse especial coidado na manipulación de mostras alimentarias sospeitosas no laboratorio, pois a toxina pode ser absorbida polas feridas recentes e nas superficies mucosas. A toxina non é inactivada no estómago e é absorbida no intestino, chegando así ás terminais presinápticas das neuronas. As bacterias causantes da brucelose, diversas especies do xénero Brucella, pertencen ao grupo 3. As diferentes especies causantes desta zoonose teñen hospedadores animais distintos: B. abortus afecta fundamentalmente o gando bovino; B. canis, os cans; B. melitensis, o gando ovino e B. suis, o porco, pero todas elas poden afectar tamén o home. Son parasitos obrigados que poden producir enfermidade aguda, crónica ou inapreciable. O home contáxiase a través da inxestión de leite ou do contacto cos tecidos infectados. Penetran a través da pel ou, pola inxestión de aerosois, a través do tubo dixestivo. O home adquire a enfermidade a partir dos animais. Os animais eliminan Brucellas polo leite, ouriños, feces, moco nasal e secrecións vaxinais en partos e abortos. As membranas fetais, a placenta e os fetos abortados conteñen gran cantidade de xermes. Os traballadores fundamentalmente expostos son os gandeiros, os que traballan en matadoiros e plantas de envasado de carne e os veterinarios. 50

46 OS AXENTES BIOLÓxICOS Mycobacterium tuberculose e M. bovis, esta última moito menos frecuente grazas á eliminación da tuberculose no gando, son as especies bacterianas causantes da tuberculose humana. Clasifícanse dentro do grupo 3, coa notación "V", posto que nos dous casos existe vacina eficaz. Teñen reservorios no medio ou en animais inferiores máis que no ser humano. O microorganismo pode sobrevivir ata seis semanas en esputos húmidos ou secos, pero a súa exposición directa á luz do sol produce a súa destrución en poucas horas. Os seus efectos dependen da virulencia do organismo e da resistencia do hospedador, así como do tamaño e da localización do inóculo. A mala nutrición e o estrés diminúen a resistencia fronte á enfermidade. Hoxe en día, a poboación máis afectada constitúena os anciáns que viven sós en barrios pobres e os individuos que viven en ambientes marxinais, asociados á droga, ao alcohol e á desnutrición. A tuberculose é unha patoloxía respiratoria clásica que, nos países avanzados, aínda que o tratamento é prolongado, non presenta problemas de curación. Só acaban desenvolvendo a enfermidade, aproximadamente, o 5% das persoas que sofren unha infección. O axente é altamente transmisible por vía aérea, ao tusir, espirrar ou falar. O risco de exposición afecta o persoal sanitario, fundamentalmente o que traballa en unidades de illamento, e a quen manipula produtos infecciosos sen sabelo; persoal que traballa nos laboratorios; e aqueles profesionais que traballan cos colectivos máis desfavorecidos. O maior risco de contaxio atópase no contacto con enfermos dos que non se sospeita a súa enfermidade. Mycobacterium bovis non só causa a tuberculose no gando, senón que tamén é moi virulento para o home. O leite non pasteurizado e os produtos lácteos de vacas tuberculosas son responsables de moitos casos de tuberculose humana. Tamén M. avium ou outros membros do xénero poden chegar a infectar o home. Por último, M. leprae (bacilo de Hansen) provoca a lepra. 51

47 OS AXENTES BIOLÓXICOS Leptospira interrogans, clasificada no grupo 2, é a responsable dunha zoonose, a enfermidade de Weil, que cursa como unha enfermidade febril grave, caracterizada por ictericia, tendencia á hemorraxia e afección renal. Os roedores e os animais domésticos son o principal reservorio de L. interrogans. O home adquire a enfermidade a través do contacto con auga contaminada polos ouriños de animais infectados ou a través do contacto directo cos seus tecidos. As bacterias penetran a través de pequenas feridas e das mucosas. O persoal que traballa en matadoiros, os mineiros, os granxeiros e aqueles traballadores que están en contacto con augas estancadas e canles son os que se atopan máis expostos a esta infección. Dentro do grupo de bacterias e afíns do anexo II do Real decreto 664/1997 atópanse as rickettsias, Rickettsia spp. e Coxiella burnetti, case todas elas pertencentes ao grupo 3, e as clamidias, coas cepas aviares de Chlamydia psittaci, tamén no grupo 3. As rickettsias e as clamidias son, ao igual que os virus, parasitos intracelulares obrigados. As clamidias teñen un ciclo vital complexo e formas diferentes de multiplicación intracelular e de transmisión extracelular. Pola contra, as rickettsias teñen só unha forma fráxil única que depende de vectores artrópodos para a súa transmisión. As rickettsias producen enfermidades como o tifo primario por piollos (R. prowazekii), tifo murino (R. typhi), tifo por carrachas (R. conorii), tifo fluvial (R. tsutsugamushi), a febre maculosa das Montañas Rochosas ou tifo exantemático (R. rickettsii), a rickettsiose vesiculosa (R. akari) e a febre Q (Coxiella burnetii). A súa transmisión aos mamíferos e, xa que logo, ao home, prodúcese por inoculación directa do axente na pel polos artrópodos (piollo, mosca, ácaro ou carracha). A única excepción é o axente da febre Q que adoita ser transmitido ao home polo po ou as pingas infectadas. Outras rickettsias poden infectar tamén por vía aérea en certas circunstancias, por exemplo, en exposicións no laboratorio ao po de feces de piollos desecadas. Na táboa 2 aparecen resumidas as principais rickettsias coas enfermidades que producen, a súa distribución e o 52

48 OS AXENTES BIOLÓxICOS modo habitual de transmisión. O control das rickettsias debe basearse no control das poboacións dos vectores artrópodos que as transmiten e dos reservorios animais no seu caso. O caso de Coxiella burnetii diferénciase das demais rickettsias porque é moi pouco estable fóra das células hóspede e a infección humana non se adquire por picadura senón por inhalación de partículas infectadas, xeralmente aerosois (bioaerosois) procedentes de animais domésticos. Esta rickettsia invade masivamente as placentas do gando vacún, ovino e caprino. Os animais preñados producen gran cantidade de bioaerosois infecciosos e causan epidemias en matadoiros. Tamén, na la contaminada pode estar a orixe de epidemias en fábricas téxtiles moi afastadas da fonte de infección orixinal. Así mesmo, aparece o axente no leite de vacas e ovellas, pero o home é pouco sensible á infección por vía gastrointestinal. O persoal dos matadoiros, a través dos aerosois producidos por animais infectados ou os seus tecidos contaminados (placentas), aqueles que traballan en fábricas téxtiles, a través da la contaminada, os gandeiros e, naturalmente, os traballadores de laboratorio poden ser traballadores sometidos a este risco. 53

49 OS AXENTES BIOLÓXICOS TÁBOA 2. Características epidemiolóxicas importantes das rickettsiose Enfermidade Grupo tifo Tifo primario por piollos Enfermidade de Brill- Zinsser Tifo murino Grupo de fiebre maculosa Febre maculosa das Montañas Rochosas Tifo por carrachas (botonoso) Rickettsiosis vesiculosa Tifo fluvial Febre Q Axente R. prowazekii R. prowazekii R. mooseri (R. typhi) R. rickettsii R. conorii* R. akari R. tsutsugamushi Coxiella burnetii Distrib. xeográfica Universal Universal Bolsas dispersas por todo o mundo Hemisferio occidental Litoral mediterráneo, do mar Caspio e Negro, África e sueste asiático E.U.A., Rusia, Corea Xapón, sueste asiático, Pacífico Oc. e Soc. Universal Rasgos epidemiolóxicos Modo habitual de transmisión ao hombre Feces de piollo infectadas fregadas Home contra a pel resgada ou como aerosol para as mucosas. Recrudescencia meses ou anos despois do ataque primario de tifo por piollos. Roedores Piojo infectado, como no tifo primario por piollos. Picadura de carracha. Picadura de carracha. Picadura de ácaro. Picadura de ácaro. Inhalación de partículas infectadas do ambiente de animais infectados. Reservorio Carrachas/roedores Carrachas/roedores; cans Ácaros/ratóns Ácaros/roedores Carrachas/mamíferos * Ademais, en Australia, R. australis (tifo por carrachas de Queensland) e, en Asia Septentrional, R. sibirica (tifo por carrachas siberiano) son entidades antixénica e geograficamente distintas. MURRAY E. S. (1984) Fungos Son un grupo constituído por organismos unicelulares (fermentos) ou pluricelulares (mofos), pero estes últimos sen diferenciación celular (os fungos poden crecer como unha célula única, fermentos, ou como colonia filamentosa multicelular, mofos). Son organismos heterotrofos (aliméntanse de materia orgánica) que viven saprofiticamente, en simbiose ou parasitando plantas ou animais. Aínda que as súas células son, en certo modo, semellantes aos dos vexetais, carecen de pigmentos fotosintéticos. A parede celular é semellante en espesor, composición química e estrutura á das células vexetais. Os mofos teñen como elemento principal de crecemento a hifa, que é unha estrutura tubular ramificada. Ao medrar, 54

50 OS AXENTES BIOLÓxICOS as hifas forman un conxunto de ramificacións entretecidas denominadas micelio, que orixinan unha colonia ou talo. As hifas diferéncianse en micelio vexetativo, que penetra no medio e absorbe as substancias nutritivas, e micelio aéreo, que crece na superficie e que, por conter as células reprodutoras ou esporas, se denomina tamén micelio reprodutor. Os fermentos son células esféricas ou ovais unicelulares, cun diámetro de 3 a 5 μm aproximadamente. En ocasións, os fermentos e a súa proxenie únense entre si para formar cadeas ou pseudohifas. Algunhas especies de fungos medran só como mofos, e outras, como fermentos; non obstante, moitas especies poden medrar nas dúas formas, segundo o medio. A capacidade de medrar nas dúas formas alternativamente chámase dimorfismo. Este fenómeno ten grande importancia clínica porque a maior parte dos fungos patóxenos para o home son dimórficos: en xeral, poden aparecer nos tecidos infectados como células de fermentos, pero cando se cultivan en condicións habituais in vitro aparecen como mofos típicos. O dimorfismo pode regularse experimentalmente modificando as condicións de cultivo e, ás veces, un só factor pode ser decisivo. Por exemplo, o patóxeno humano Blastomyces dermatitidis crece formando micelio a 25º C, pero como fermento a 37º C. En xeral, as formas micelares que conducen á diseminación aérea de esporas son unha resposta a condicións desfavorables, en tanto que as formas de fermento son favorecidas por unha nutrición abundante. A reprodución efectúase sexual e asexualmente. O mecanismo máis sinxelo de reprodución é a xemación, que se produce nos fungos unicelulares como os fermentos. En formas pluricelulares ten lugar a formación de esporas. Estas orixínanse no extremo de hifas especiais, como é o caso dos conidios (conidiomicetos), ou no interior de esporanxios, como, por exemplo, nas ascas (ascomicetos) e os basidios (basidiomicetos). As esporas disemínanse con facilidade a través do aire e xerminan en condicións ambientais adecuadas (elevada humidade e, preferiblemente, temperatura morna) dando lugar a unha nova colonia ou mofo. Todos 55

51 OS AXENTES BIOLÓXICOS estamos diariamente expostos a esporas fúnxicas no aire que respiramos. O conxunto de todos os efectos que producen os fungos, en relación coa vida humana, tal vez sexan máis beneficiosos que prexudiciais, pois interveñen na degradación das substancias orgánicas do chan e utilízanse industrialmente na produción de penicilina, corticosteroides, ácidos orgánicos; e na elaboración de queixos, pan e bebidas alcohólicas. De todas as especies de fungos existentes ædescoñécese o número exacto, pero estímase que supera o millónæ só se coñecen unhas 100 capaces de causar enfermidades infecciosas (micóticas) no home. Unhas poucas destas, que teñen predilección especial polas estruturas epidérmicas, parecen depender dos tecidos animais para o seu crecemento, e algunhas son parasitos obrigados do home. Para a maior parte das outras especies patóxenas, a infección no home e en diversos animais é só un incidente eventual sen importancia ecolóxica para o microbio. Ademais dos fungos causantes de enfermidades infecciosas, hai que ter en conta aqueloutros que producen outros efectos negativos sobre a saúde das persoas expostas, de tipo irritativo, alérxico ou tóxico. Tipos de micoses Resulta útil dividir as micoses (enfermidades infecciosas producidas polos fungos) en catro grupos, que se diferencian entre si segundo os tecidos en que se localiza a infección (Kobayashi, 1984): As micoses xeneralizadas ou profundas afectan fundamentalmente os órganos internos e as vísceras. A miúdo se atopan diseminadas polo organismo e afectan distintos tecidos. As micoses subcutáneas afectan a pel, tecido subcutáneo, fascias e ósos. 56

52 OS AXENTES BIOLÓxICOS As micoses cutáneas afectan a epiderme, cabelos e uñas. Os fungos responsables destas infeccións denomínanse dermatófitos, e as enfermidades que causan, dermatofitose ou dermatomicose. As micoses superficiais afectan só os cabelos e as capas máis superficiais da epiderme. As micoses sistémicas ou profundas son producidas por fungos saprófitos que se encontran no chan, iniciándose o proceso infeccioso mediante a inhalación de esporas. Estas infeccións lembran, dende o punto de vista clínico, as infeccións bacterianas crónicas por micobacterias e por actinomicetos. As lesións iniciais afectan xeralmente o pulmón, producen unha pneumonite aguda e autolimitante que moitas veces pasa inadvertida ou é atribuída a bacteria ou virus. A forma crónica subseguinte (que polo xeral é moito menos frecuente) empeza insidiosamente, progresa con lentitude e está caracterizada por lesións supurativas ou granulomatosas. En ocasións, forman cavidades pulmonares e, en xeral, difúndense por extensión directa, é dicir, por continuidade aos tecidos brandos, tales como as pleuras. Estes fungos tenden a metastatizar a través da corrente sanguínea e poden producir abscesos ou granulomas metastásicos na maior parte dos órganos e mesmo na pel. Antes do desenvolvemento dunha quimioterapia antifúnxica eficaz, estas enfermidades micóticas diseminadas eran case sempre mortais. Non son contaxiosas. As micoses subcutáneas son tamén producidas por saprófitos que se atopan no chan ou na vexetación. A infección prodúcese por implantación directa das esporas ou fragmentos de micelios con frecuencia nas excoriacións producidas por picadas; por iso tenden a ser máis frecuentes nas zonas rurais e tropicais, é dicir, nos terreos selváticos. As enfermidades comezan insidiosa e progresivamente, e caracterízanse pola formación de abscesos e granulomas subcutáneos, que se difunden por extensión directa e que, ás veces, causan fístulas na superficie cutánea, formando lesións ulceradas crónicas supurantes e cicatrizantes. A difusión pode realizarse tamén a través dos vasos linfáticos, 57

53 OS AXENTES BIOLÓXICOS o cal produce lesións granulomatosas e supuradas nos ganglios linfáticos das cadeas rexionais. Estas enfermidades son a miúdo moi desfigurantes, e non é raro que o seu desenlace sexa fatal, aínda que é rara a diseminación ás vísceras. Estes abscesos cutáneos localizados, que son particularmente invasores e destrutores dos tecidos brandos, de fascias e de ósos, denomínanse micetomas. Caracterízanse pola presenza de fístulas e tractos sinuosos e tortuosos que abren a superficie cutánea. As descargas purulentas e os abscesos conteñen frecuentemente gránulos, que son masas de colonias dos microorganismos causais. Hai algúns abscesos que son clinicamente indiferenciables destes, tales como os causados por certas bacterias (Notocardia; Streptomyces). Os micetomas fúnxicos denomínanse en ocasións maduromicoses. Os fungos que producen micoses cutáneas presentan unha destacada predilección para medrar na epiderme, no pelo e nas uñas. Só algunhas destas especies patóxenas se atoparon no chan, e só unha delas, Microsporum gypseum, se encontra con certa frecuencia. A maior parte dos outros dermatófitos atópanse unicamente na pel dos mamíferos. Parecen ser parasitos obrigados do home e outros animais, e transmítense por contacto directo con individuos contaminados ou por escamas epidérmicas. As enfermidades que causan tenden a ser crónicas, a resposta inflamatoria áchase confinada á zona da pel onde se localiza a infección e non adoita ser destrutiva. Os dermatófitos adquiridos polo home do chan (M. Gypseum) ou dos animais (M. Canis, de cans e gatos) tenden a producir unha reacción inflamatoria intensa, pero transitoria, na pel, mentres que as que son indíxenas no home, e aparentemente son parasitos obrigados, en xeral, só provocan reaccións sen importancia. Parece que o home é máis tolerante ás especies de dermatófitos propias que ás especies estrañas. 58

54 OS AXENTES BIOLÓxICOS Os fungos que causan micoses superficiais localízanse nos cabelos e nas zonas superficiais mortas da epiderme. As lesións patolóxicas son pouco importantes. Certos saprófitos fúnxicos moi difundidos case nunca provocan infeccións en persoas sas, pero poden causar unha enfermidade grave naquelas que padecen diversos procesos que diminúen a súa resistencia. As enfermidades causadas por estes fungos oportunistas poden ser moi diseminadas ou poden estar localizadas no aparato respiratorio ou nas mucosas e na pel. Principais fungos parásitos 1.- Micoses xeneralizadas Cryptococcus neoformans (criptococose) Blastomices dermatitidis (blastomicose) Histoplasma capsulatum (histoplasmose) Coccidioides immitis (coccidioidomicose) Paracoccidioides brasiliensis (paracoccidioidomicose) 2.- Micoses producidas por fungos oportunistas Candida albicans (candidiase) Aspergillus fumigatus (asperxilose).- granxeiros e traballadores que manipulan vexetais secos; as esporas tamén son diseminadas polos humidificadores e filtros e canalizacións de aire acondicionado. Provocan neumonite de hipersensibilidade, asma e rinite. Rhizopus spp., Phycomyces spp., Mucor spp. etc. (ficomicose) 3.- Micoses subcutáneas Sporothrix schenckii (esporotricose) Fonsecaea compacta, F. pedrosi, F. dermatitidis (cromomicose) Madurella mycetomatis, M. grisea (maduromicose) 59

55 OS AXENTES BIOLÓXICOS 4.- Micosis cutáneas (dermatomicoses) Microsporum spp.(afeccións ectótricas do cabelo, tiña da cabeza ) Trichophyton spp. (T. rubrum e T. mentagrophytes - pé de atleta -; e este último tamén infeccións endótricas de coiro cabeludo e barba; T. violaceum infección endótrica do cabelo e favo ; T. tonsurans infeccións endótricas do cabelo - tiña do coiro cabeludo ) Epidermophyton floccosum (entre as dedas dos pés; non afecta aos cabelos) 5.- Micoses superficiais Pityrosporum spp. (pitiriase versicolor) Cladosporium werneckii ( tiña negra ) Trichosporum cutaneum ( pedra branca ) Piedraia hortai ( pedra negra ) Cryptococcus neoformans (criptococose) O C. neoformans clasifícase no grupo 2 no anexo do Real decreto 664/1997. A inhalación dos fermentos considérase a causa da infección pulmonar inicial, que posteriormente se disemina por vía sanguínea a outras vísceras e ao sistema nervioso central (SNC), especialmente en individuos inmunodeprimidos. Son frecuentes as infeccións silentes de pulmón e só unha porción moi pequena se estende. Na forma crónica da enfermidade poden resultar afectados o cerebro, os pulmóns, outras vísceras, a pel e os ósos. A meninxite crónica é a forma máis frecuente da enfermidade e aseméllase á meninxite tuberculosa. As lesións parenquimatosas no SNC poden simular un absceso cerebral ou un tumor cerebral. A criptococose que afectaba o SNC con lesións viscerais, diseminadas ou non, era invariablemente mortal, pero a anfotericina B curou a infección mesmo cando se lle administrou a unha persoa moi grave. A criptococose aparece esporadicamente por todo o mundo. O microorganismo foi illado do chan, especialmente daquel enriquecido con excremento de pombas. Tamén 60

56 OS AXENTES BIOLÓxICOS se atopa en pombais, niños, etc. Describíronse pequenas epidemias de infección pulmonar aguda en traballadores ocupados na demolición de edificios antigos. Os fungos poden permanecer vivos no material seco durante meses, polo que o material contaminado constitúe unha fonte de infección aérea. Blastomyces dermatitidis (blastomicose) B. Dermatitidis, clasificado dentro do grupo 3, crece como células de fermento nos tecidos infectados ou en cultivos a 37º C e como fungo a 25º C en medios convencionais. Pode illarse doadamente en Sabouraud (peptona e glicosa; engádese cloranfenicol e cicloheximida) ou nun medio igualmente simple. A infección comeza habitualmente nos pulmóns e difúndese por vía sanguínea, causando lesións destrutivas focais nos ósos, pel, próstata e outras vísceras. En xeral, non afecta o tubo dixestivo. As lesións cutáneas son particularmente manifestas; parece orixinarse como metástase a partir das lesións pulmonares primarias. A enfermidade causada por B. Dermatitidis áchase practicamente confinada a Canadá e Estados Unidos. Considérase un saprófito do chan e foi cultivado no laboratorio en chan esterilizado. Non obstante, rara vez deron resultado os numerosos intentos de illalo do chan. Histoplasma capsulatum (Histoplasmose) H. Capsulatum, tamén clasificado dentro do grupo 3, aparece nos tecidos infectados como un fermento oval. Atópase no chan e a inhalación das aleuriosporas, transportadas polo aire, conduce á infección pulmonar. Aparecen lesións miliares distribuídas por todo o parénquima pulmonar e aumento do tamaño dos ganglios linfáticos. A infección inicial é benigna. Coa curación, as lesións pul- 61

57 OS AXENTES BIOLÓXICOS monares vólvense fibróticas e calcifícanse, dando unha imaxe radiolóxica característica de histoplasmose curada. Aínda que a maioría das persoas infectadas son asintomáticas ou presentan leves síntomas que non requiren atención médica, nalgúns individuos a enfermidade progresa e disemínase, causando lesións practicamente en todos os tecidos e órganos. Cando hai síntomas, estes maniféstanse xeralmente entre os 3 e os 17 días despois da exposición, cunha media de 10 días (DHHS-NIOSH Publication nº ). Aparecen febres e prostración, así como aumento do tamaño do fígado, bazo e ganglios linfáticos, simulando tuberculose miliar. En ocasións, a histoplasmose pode evolucionar como unha enfermidade pulmonar crónica con cavitación, simulando a tuberculose pulmonar crónica. Illouse H. Capsulatum do chan, en especial onde estaba fortemente contaminado por excrementos de aves e morcegos: celeiros, galiñeiros, covas e preto das árbores nas que aniñan as aves. Os excrementos das aves enriquecen o chan como un medio de cultivo, pero as aves non desenvolven a enfermidade, nin transportan o microorganismo, posiblemente debido a que non pode desenvolverse a súa elevada temperatura corporal. Son grupos de risco, entre outros, os traballadores da construción, en especial aqueles que realizan demolicións, restauradores de edificios históricos ou abandonados, granxeiros e traballadores agrícolas, exploradores de covas e, por suposto, os traballadores de laboratorio microbiolóxico. H. capsulatum var. Duboisii é unha variante que provoca a histoplasmose en África, e distínguese polas súas grandes células ovoides. Coccidioides immitis (coccidioidomicose) Pode causar unha infección respiratoria benigna, unha aguda, ou unha enfermidade xeral mortal. Clasifícase, en función do seu risco de infección, no grupo 3. No 1% dos casos aparece unha diseminación con lesións granulomatosas 62

58 OS AXENTES BIOLÓxICOS sépticas en moitos órganos e tecidos, entre eles a pel, ósos e articulacións. C. immitis crece como saprófito en chans desérticos do suroeste de Estados Unidos e o norte de México. A infección establécese por inhalación de esporas transmitidas polo aire e a enfermidade é coñecida como coccidioidomicose. A enfermidade xeneralizada foi mortal ata que se dispuxo dos antibióticos poliénicos. Paracoccidioides brasiliensis (paracoccidioidomicose) P. brasiliensis é probablemente un saprófito do chan que, ao igual que os anteriores, polo seu risco de infección ao home, se clasifica no grupo 3. A enfermidade causada coñécese como paracoccidioidomicose ou blastomicose sudamericana. As primeiras lesións aparecen nas mucosas da boca ou do nariz e difúndense por expansión directa, é dicir, a través dos límites cutáneo-mucosos afectan a cara. En ocasións, a diseminación prodúcese a través dos tecidos linfáticos. No tubo dixestivo poden producir úlceras e mesmo perforacións. Poden formarse abscesos subcutáneos que, por extensión da superficie cutánea, poden producir lesións deformantes de gran tamaño, encostradas ou ulceradas. A enfermidade que causa sinalouse principalmente en Brasil e noutros países de América Central e do Sur. Pero, ademais destes fungos infecciosos, en hixiene industrial teñen grande importancia, e cada vez máis, aqueloutros que son responsables de producir enfermidades alérxicas, en particular, a pneumonite por hipersensibilidade ou a síndrome tóxica do po orgánico. Husman (1996) realizou unha revisión dos efectos que os microorganismos que crecen no aire interior poden provocar sobre a saúde das persoas. Estas alteracións comprenden: síntomas irritativos non específicos, infeccións respiratorias, enfermidades alérxicas, alveolite e síndrome tóxica do po orgánico, e outras enfermidades pulmonares crónicas (bronquite crónica, por exemplo). Como calquera material biolóxico, algúns fungos son coñecidos alérxenos que poden causar rinite alérxica, asma e conxuntivite alérxica. Dentro deste grupo de fungos, os máis importantes son os pertencentes 63

59 OS AXENTES BIOLÓXICOS aos xéneros Alternaria, Cladosporium, Aspergillus e Botrytis, no aire exterior; Penicillium, Aspergillus, Mucor ou Rhizopus, en ambientes interiores; Fusarium e Aureobasidium, en granxas e casas vellas; e Stachybotrys chartarum, máis coñecido polos seus efectos tóxicos. Os alérxenos fúnxicos atópanse principalmente nas esporas, pero tamén noutras estruturas como os micelios. A enfermidade non infecciosa máis severa causada polos fungos é a alveolite alérxica ou pneumonite por hipersensibilidade. A máis coñecida destas alveolites é o pulmón do granxeiro, pero tamén afecta outros profesionais que traballan en serradoiros ou en invernadoiros, os que se dedican ao cultivo de champiñóns e, con menor frecuencia, os que traballan no interior de edificios. Esta enfermidade é producida por partículas biolóxicas cun tamaño suficientemente pequeno para alcanzar os alvéolos, condición que cumpren as esporas dos xéneros Acremonium, Penicillium e Aspergillus. Aspergillus fumigatus (asperxilose) afecta a granxeiros e traballadores que manipulan vexetais secos; as esporas tamén son diseminadas polos humidificadores e filtros e canalizacións de aire acondicionado. Provocan pneumonite de hipersensibilidade, asma e rinite. Mención especial merecen os fungos produtores de toxinas. As micotoxinas e, en particular, as aflatoxinas e tricotecenos son metabolitos secundarios producidos polos fungos e que son tóxicos para as células animais e humanas (Martí et alii, 1994). Moitas micotoxinas causan efectos sistémicos particularmente no fígado e no sistema nervioso. As aflatoxinas foron descubertas por primeira vez en Aspergillus flavus (A. flavus) de onde toman o seu nome. Os tricotecenos son micotoxinas derivadas do escirpeno (composto terpénico de 4 ciclos) que son moi solubles en auga e poden acharse en forma de bioaerosois no medio. Os tricotecenos prodúcenos especies como Fusarium, Cephalosporium, Giberella, Myrothecium, Stachybotrys, Trichothecum e Trichoderma. As micotoxinas, á parte de afectar órganos concretos, tamén alcanzan os sistemas nervioso e inmunitario e presentan carácter carcinóxeno. En doses subletais, 64

60 OS AXENTES BIOLÓxICOS os tricotecenos matan as células do sistema inmune, mentres que doses baixas modulan a resposta inmune. Nos edificios danados pola auga, Stachybotrys chartarum é o fungo máis importante na produción de micotoxinas; pero, ademais, ten efectos alérxicos e pode causar asma e rinite. Tamén é corrente atopar o xénero Fusarium, pero este é máis común en ambientes de granxas (Husman, 1996). Resumindo, podemos dicir que, aínda que a maior parte dos fungos producen micotoxinas, os máis coñecidos, e posiblemente os que presentan metabolitos máis tóxicos, son as especies dos xéneros Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Stachybotrys e Myrothecium, que non son abundantes no exterior, pero que poden ser contaminantes habituais en ambientes interiores. Tamén os xéneros Alternaria e Cladosporium, aínda que non tóxicos como os anteriores, son comúns no interior. Relación de principais fungos parasitos e da súa localización no home A pesar de que se sabe da existencia dalgunhas enfermidades parasitarias dende a antigüidade, o coñecemento que temos sobre os organismos parasitos é, en xeral, escaso. Para a maioría da poboación, afortunadamente, as enfermisistémica sistémica/oportunista subcutánea cutánea Blastomyces dermatitidis Histoplasma capsulatum Coccidioides immitis Paracoccidioides brasiliensis Cryptococcus neoformans Candida albicans Aspergillus fumigatus Rhizopus spp. Phycomyces spp. Mucor spp. Sporothrix schenckii Fonsecaea compacta Fonsecaea pedrosi Madurella mycetomatis Madurella grisea Microsporum spp. Trichophyton rubrum Trichophyton spp. Epidermophyton floccosum ENDOPARASITOS 65

61 OS AXENTES BIOLÓXICOS dades causadas por organismos parasitos non están de moda. Este esquecemento, que carece de xustificación, tanto pola gravidade das enfermidades que ocasionan, coma polo número de persoas afectadas no mundo, só poden entenderse dende un punto de vista egoísta : nos países occidentais, as enfermidades parasitarias máis graves atópanse baixo control. Non obstante, algúns datos poden axudarnos a situar os endoparasitos na súa xusta dimensión. Revisando os informes do Centro de Control da Enfermidades Infecciosas de EE.UU. (CDC) e da Organización Mundial da Saúde (OMS) poden lerse datos estremecedores. Sirvan de mostra os que mencionamos a continuación. As filarias dos xéneros Brugia e Wuchereria afectan a uns 120 millóns de persoas en 80 países das rexións tropicais e subtropicais de Asia, África, Pacífico Oeste e partes do Caribe e de Sudamérica. As persoas infestadas por este verme sofren dor, desfiguración e impotencia sexual. Tamén as rexións tropicais e subtropicais son o lugar de distribución dos protozoos do xénero Leishmania. Os 350 millóns de persoas que, aproximadamente, habitan estas áreas están expostas a contraer esta enfermidade, a leishmaníase que, en individuos non tratados, é frecuentemente mortal. O 20% da poboación mundial, principalmente a que vive nos países máis pobres do mundo, corre o risco de contraer a malaria. A malaria causa máis de 300 millóns de enfermidades agudas e mata, polo menos, a un millón de persoas ao ano. Máis de nenos africanos morren diariamente a consecuencia desta enfermidade. Tradicionalmente, o parasitismo era considerado como unha asociación negativa entre animais na que o parasito vive a expensas do hospedador. A contribución realizada polos estudos sobre bioloxía molecular dos parasitos fixo que hoxe en día non se xustifiquen as definicións que ata agora se viñan dando para as distintas asociacións entre animais: parasitismo (unha asociación entre animais na que un sae beneficiado e o outro prexudicado), simbiose (os dous membros da asociación saen beneficiados), mutualismo (existe dependencia metabólica entre os dous compoñentes), comensalismo (un dos membros da asociación sae 66

62 OS AXENTES BIOLÓxICOS beneficiado e o outro nin beneficiado nin prexudicado), foresis (relación de carácter temporal sen dependencia metabólica). Non se mantén, pois, a idea de que o parasito é un animal que lle causa dano ao seu hospedador. Hoxe en día, enténdese o parasitismo como un estado no cal un organismo (parasito) é metabolicamente dependente, en maior ou menor grao, doutro (o hospedador). Neste sentido pode ser útil sinalar que formas son prexudiciais, cales non o son, e mesmo cales poden ser beneficiosas para o hospedador. Acción dos parasitos sobre os seus hospedadores. Existen moitas especies de parasitos que son relativamente inocuas, pero existen outras moitas formas parasitarias que producen efectos patolóxicos que poden conducir a un estado grave ou mesmo á morte do hospedador. Os efectos son moi diversos e, en moitos casos, representan unha combinación de moitas causas distintas: - competencia co hospedador pola comida, p. e. Diphyllobotrium latum (pescado cru, escabechado ou caviar), o que provoca anemia macrocítica e hipocrómica, froito da competencia entre o parasito e o hospedador pola vitamina B 12. Tamén a diminución do aproveitamento dos alimentos polo hospedador, ben sexa pola redución do apetito, ben pola infrautilización de substancias nutritivas ao paso dos alimentos polo tracto dixestivo ou, tamén, por cambios na capacidade de absorción da superficie intestinal con alteracións no equilibrio hídrico e intercambio iónico (NA+, Cl-). - destrución de tecidos e líquidos biolóxicos do hospedador polo parasito, como no caso de nematodos succionadores de sangue (Haemonchus spp., en ruminantes), artrópodos (moscas succionadoras de sangue, carrachas...); destrución de tecidos do hospedador na migración do parasito ou das súas larvas; lesións polos órganos de fixación (coroa de espiñas ou dentes, ganchos, ventosas...), pola presión exercida ao medrar o parasito (cistes hidatídicos) ou por obstrución de condutos, tales como vasos sanguíneos (Strongylus), 67

63 OS AXENTES BIOLÓXICOS vasos linfáticos ata producir edema e elefantíase (filaríase) ou tracto intestinal ata producir necrose e perforación (ascárides). - infeccións secundarias de tipo bacteriano que poden afectar ás lesións producidas polo parásito (p.e., úlcera intestinal) e a propia reacción do hospedador poden producir a destrución de tecidos. A consecuencia final pode ser a fibrose da lesión (p.e. a cirrose producida por Fasciola hepática), proliferación excesiva dun tecido, p.e. o linfático (Leshmaniasis); necrose, dermatite ou edema. Unha característica destacable dos endoparasitos é que moitos deles posúen ciclos biolóxicos complexos coa necesaria participación dun ou varios hospedadores intermediarios. A enfermidade que produce o endoparasito no home é máis grave cando este funciona como hospedador intermediario que cando é o hospedador definitivo. Esta mesma complexidade do ciclo biolóxico do parasito vainos permitir atacar o axente de diferentes modos. Pódese actuar sobre o reservorio, sobre os vectores encargados de transmitilo ou sobre os hospedadores dos devanditos axentes. Dentro dos endoparasitos humanos hai que destacar os protozoos e os helmintos. Protozoos Os protozoos son animais unicelulares, pero, a diferenza das bacterias, son eucarióticos, é dicir, presentan o material xenético dentro dun núcleo rodeado por unha membrana e non teñen parede celular. Constitúen este grupo organismos unicelulares heterotrofos de características animais: desprazamento (esvaramento, pseudópodos, flaxelos ou cilios); irritabilidade ante diversos estímulos; captura de alimento (pseudópodos, citostoma); complexidade dos fenómenos dixestivos (vacúolo 68

64 OS AXENTES BIOLÓxICOS dixestivo), etc. O tamaño dos protozoos pode oscilar entre límites tan amplos como 3 e 800 μm. Viven en ambientes húmidos ou acuáticos, e son, xeralmente, de vida libre, aínda que os esporozoos son totalmente parasitos. Algúns deles son parasitos de vertebrados. O seu ciclo vital é complexo, e nalgúns casos precisan de varios hospedadores para completar o seu desenvolvemento. A transmisión dun hospedador a outro realízana xeralmente os insectos que, neste caso, se denominan vectores. O corpo do animal está rodeado por unha membrana plasmática que pode estar recuberta por unha fina película ou membrana de secreción de natureza orgánica (péctica ou celulósica), como en moitos flaxelados, ou inorgánica (impregnacións de sales minerais: sílice, caco3, etc.) nos rizópodos. O desprazamento efectúase mediante pseudópodos, cilios (ciliados) ou flaxelos (flaxelados). Os protozoos aliméntanse principalmente de algas unicelulares, bacterias ou doutros protozoos ou, simplemente, de partículas de materia orgánica presentes no medio. A reprodución asexual prodúcese por simple división binaria ou bipartición, ou por esporulación, tamén por xemación. A división binaria comporta un proceso case idéntico á da mitose nas células dos metazoos. A esporulación efectúase nos esporozoos (o núcleo divídese varias veces antes de que aconteza a división citoplasmática), o cal lles permite a estes protozoos parasitar numerosas células nun curto período de tempo. Os ciliados levan a cabo un fenómeno de sexualidade, denominado conxugación, que consiste na fusión temporal de dous individuos pola rexión do citostoma, á que seguen unhas modificacións dos macro e micronúcleos que conducen á formación de dous individuos cun material hereditario algo diferente do orixinal. Outros protozoos presentan un fenómeno de reprodución sexual, a singamia, que implica a formación de gametos que se unen para producir un cigoto. A esta singamia séguelle un proceso de reprodución asexual, a esporogonia, que consiste nunha fisión múltiple. 69

65 OS AXENTES BIOLÓXICOS Son varias as familias de protozoos patóxenas para o home. De entre elas hai que destacar a familia Trypanosomatidae que comprende os tripanosomas. Estes parasitos evolucionaron a partir de formas parasitarias do tubo dixestivo (TD) dos insectos e, moitos deles, parasitan o sangue e os tecidos dos mamíferos, incluído o home, e das aves. Pertencen a esta familia algúns parasitos clasificados no grupo 3 no anexo II do Real decreto 664/1997 como as leishmanias, Leishmania brasiliensis e L. donovani, e os tripanosomas, Trypanosoma brucei rhodesiense e T. cruci. Os tripanosomas aparecen principalmente no sangue e tecidos fluídos de vertebrados e son transmitidos por artrópodos hematófagos, nos que desenvolven determinadas fases evolutivas. O protozoo multiplícase nas glándulas salivares destes artrópodos. O T. brucei rhodesiense é o máis patóxeno dos tripanosomas africanos. A enfermidade clínica maniféstase dunha forma máis aguda e chega a implicar o sistema nervioso central. A morte, que pode producirse en poucos meses, é común en casos non tratados. O T. cruci causa a tripanosomíase humana americana ou enfermidade de chagas en América do Sur, tamén está estendida en EE.UU. Transmítese por chinches hematófogas a partir de moitos animais, entre eles os cans, que serven como hospedadores intermediarios. A enfermidade no home pode ser aguda ou crónica. A primeira preséntase, sobre todo, en nenos e mozos. A morte pode sobrevir nun período de dúas a catro semanas despois da aparición dos síntomas (reacción inflamatoria local e encapsulación por tecido fibroso, produción de edema na zona afectada) ou pode resolverse na forma crónica da enfermidade. As leishmanias teñen como insecto vector a diferentes especies do xénero Phlebotomus (beatillas). Leishmania donovani produce a enfermidade de kala-azar ou leishmaníase visceral (Rusia, India, Mediterráneo e América) que alcanza unha mortalidade que oscila entre o 70 e o 90% dos casos non tratados. L. brasiliensis produce a leishmaníase cutánea americana. As lesións cutáneas son crónicas e, ás veces, a invasión das mucosas produce gran desfiguración. A enfermidade pode prolongarse durante varios anos e en 70

66 OS AXENTES BIOLÓxICOS poucas ocasións se logra unha curación espontánea. A morte pode ser provocada por septicemia ou pneumonía bronquial. Tamén a familia Plasmodiidae, que comprende os parasitos responsables da malaria do home e doutros mamíferos e vertebrados, ten no Plasmodium falciparum un representante no grupo 3 da clasificación do Real decreto 664/1997. Atópase amplamente distribuído nos trópicos, pero é pouco frecuente nas zonas temperadas do mundo. Transmítese, ao igual que as leishmanias e os tripanosomas, pola intervención dun artrópodo como vector, neste caso, un mosquito do xénero Anopheles. As enfermidades destas familias de parasitos poden afectar traballadores que desenvolven a súa actividade en zonas onde a enfermidade é endémica e naqueles laboratorios que utilizan estes parasitos nas súas investigacións. O seu control baséase no control sobre os seus vectores artrópodos responsables da transmisión da enfermidade; o control daqueles animais que poden ser reservorios desta; e a utilización de roupa de protección, repelentes para insectos, etc. Estes axentes que, como vimos, se distribúen polas rexións tropicais e subtropicais do planeta, han de ser considerados como un perigo potencial en rexións máis setentrionais xa que, como consecuencia do cambio climático, a área de distribución dos artrópodos que funcionan como vectores pódese estender a outras áreas próximas, e así o entende a OMS que nos pon en alerta nun informe sobre efectos do cambio climático. Outros protozoos parasitos ao que lle hai que prestar especial atención é o Toxoplasma gondii, que aínda que se clasifica no grupo 2, é especialmente perigoso para as mulleres embarazadas xa que se transmite por vía transplacentaria e pode producir graves deformacións no feto. O home só actúa como hospedador intermediario de T. gondii, e é o gato o seu hospedador definitivo (figura 6). É persoal de risco aquel que se atopa en contacto cos gatos ou que manexa materiais infectados: persoal de laboratorios de microbioloxía, veterinarios e os que manipulan carne 71

67 OS AXENTES BIOLÓXICOS contaminada, etc. Debe evitarse que as mulleres embarazadas realicen tarefas nas que exista risco de contacto con este parasito. Figura 6.- Ciclo biolóxico de Toxoplasma gondii HOSPED. DEFINITIVO Gato (ZOÍTOS) Rato infectado (BRADIZOÍTOS) Esporogonia en feces (OOQUISTES) HOSPED. INTERMEDIARIOS Rato e outros mamíferos entre eles o home (ZOITOS >> CISTES) O gato actúa como hospedador definitivo. Inféctase ao comer carne contaminada (rato). O protozoo multiplícase no intestino (traquizoítos e bradizoítos) e forma oocistes que son eliminados coas feces. Cando os oocistes esporulados son inxeridos por un hospedador intermediario, entre eles o home, desenvólvese un ciclo extraintestinal que afecta diferentes órganos (músculo esquelético, corazón, cerebro, etc.) onde forma cistes con miles de bradizoítos. Nestes hospedadores intermediarios prodúcese transmisión transplacentaria. O gato pode infestarse pola inxestión de oocistes e, neste caso, a multiplicación sería como nun hospedador intermediario. Helmintos A palabra helminto provén do grego helmis ou helminthos e significa verme. Os helmintos son animais pluricelulares con ciclos vitais complicados e con diversas fases no seu desenvolvemento. É frecuente que completen cada unha das súas fases (ovo-larvar-adulto) en diferentes hospedadores (animais/home), e que a transmisión dun hospedador a 72

68 OS AXENTES BIOLÓxICOS outro sexa realizada por diferentes vectores (feces, auga, alimentos, insectos, roedores... ). O grupo dos helmintos comprende os vermes non segmentados (estes formarían o philum dos anélidos), e divídese en dous subgrupos principais que son os platelmintos que son vermes esmagados dorsoventralmente, normalmente hermafroditas, sen sistema respiratorio nin circulatorio e cun ciclo vital que adoita ser indirecto, como é o caso de os trematodos (doelas) e os cestodos (tenias e Echinococcus); e o subgrupo dos nematelmintos que son vermes cilíndricos, con dous extremos normalmente aguzados, de sexos separados e ciclos biolóxicos directos ou indirectos, como é o caso dos ascárides (Ascaris lumbricoides) e trichuridos (Trichinella spiralis). Fóra do fío dos helmintos, habería que citar as samesugas, que se inclúen no fío dos anélidos, na clase dos hirudíneas. Estes helmintos, que poden ter certa importancia en áreas endémicas para aqueles traballadores que están en contacto coa auga, non entran dentro da definición de axente biolóxico dada no Real decreto 664/1997, o que non impide que, ao igual que outros ectoparasitos, deba terse en conta ao realizar a avaliación de riscos e a planificación da acción preventiva. A Taenia solium e as tres especies de Echinococcus: E. granulosus, E. multiloculares e E. vogeli, atendendo ao seu risco de infección e á gravidade das enfermidades que producen, clasifícanse no grupo 3. A tenia ten o home como hospedador definitivo, mentres que para os Echinococcus é un hospedador intermediario. A T. solium é parasito do intestino delgado do home onde pode superar os 5 metros de lonxitude e vivir ata 25 anos. A infestación prodúcese por inxestión de carne, xeralmente de porco, contaminada con cisticercos. O parasito é liberado no tubo dixestivo e desenvólvese ata o estado adulto no intestino. Non obstante, pode acontecer que o home funcione como hospedador intermediario logo da inxestión de ovos coa comida ou sucidade das mans. Neste caso, a oncosfera eclosiona e actívase pola acción dos xugos gástricos e intestinais, penetrando na 73

69 OS AXENTES BIOLÓXICOS mucosa intestinal. Dende alí, os embrións alcanzan o sistema circulatorio e disemínanse por todo o corpo. No home os cisticercos desenvólvense principalmente no tecido subcutáneo, pero pode alcanzar o cerebro e o globo ocular, onde o dano pode ser moi grave. No caso dos Echinococcus o home actúa como hospedador intermediario. O E. granulosus ten unha ampla distribución. Parasita o intestino delgado dos carnívoros, especialmente o do can (tamén o do gato), e o ciste hidatídico desenvólvese nos hospedadores intermediarios (moitas especies de ungulados e o home) (figura 7). Unha fonte de infestación importante para o home é a inxestión de froitas e verduras contaminadas polas feces do hospedador definitivo. A patoxenia do ciste hidatídico depende da gravidade da infestación e do órgano de localización. É particularmente importante cando afecta o cerebro ou o corazón. Xa que os ciclos biolóxicos dos cestodos son indirectos, a prevención pódese basear no control dos hospedadores intermediarios. A vía de penetración é a oral, polo que as medidas hixiénicas encamiñadas a previr esta contaminación (non comer, nin beber, nin fumar no lugar de traballo; usar roupa de protección e lavarse despois dun posible contacto) son moi útiles como medida preventiva. Outros endoparasitos de destacada importancia, tanto polo número de persoas afectadas, coma pola gravidade das malformacións que produce son as filarias. A enfermidade transmítese de persoa a persoa, coa intervención dun mosquito como vector. Cando un mosquito pica a unha persoa infectada, as larvas microscópicas que circulan polo seu sangue pasan ao mosquito que, ao picar de novo, pode transferir as devanditas larvas a outro individuo. As larvas microscópicas viaxan ata os vasos linfáticos e alí desenvólvense. Un individuo adulto vive uns sete anos e durante este tempo libera millóns de vermes microscópicos ao sangue. A enfermidade non adoita ser mortal, pero provoca danos permanentes no sistema linfático e nos riles. Ao non circular os fluídos correctamente a través do sistema linfático prodúcese acumulación de líquidos nas extremidades e, no home, na área xenital. 74

70 OS AXENTES BIOLÓxICOS Figura 7.- Ciclo biológico de Echinococcus granulosus HOSPED. DEFINITIVO CARNÍVOROS ((CESTODO ADULTO)) Animal infectado (PROTOESCOLEX) Ovos en feces (ONCOSFERA) HOSPED. INTERMEDIARIOS cabalos, ovellas, vacas, porcos tamén o home (CISTES HIDATÍDICOS) O adulto atópase parasitando o intestino delgado dos carnívoros (can) que son os seus hospedadores definitivos. O proglótide grávido desintégrase no intestino e elimínanse os ovos coas feces. Ao ser inxeridos polo hospedador intermediario, a oncosfera alcanza, a través do sistema linfático, os pulmóns ou outros órganos onde desenvolve os cistes hidatídicos. Nestes fórmanse vesículas fillas que conteñen protoescólex. O ciclo biolóxico péchase cando o carnívoro inxire carne contaminada por estes protoescólex. 75

71 OS AXENTES BIOLÓXICOS CULTIVOS CELULARES Os primeiros hóspedes utilizados nos traballos de experimentación ou de diagnóstico para virus foron animais adultos ou os seus embrións. Na actualidade foron case totalmente substituídos polos cultivos de células animais. O desenvolvemento de novos métodos para o cultivo de células animais in vitro contribuíu de forma extraordinaria ao progreso da viroloxía animal, e á análise da función xénica, da regulación metabólica e doutros problemas de fisioloxía das células animais. Estes métodos proporcionáronlle ao investigador técnicas cuantitativas para o estudo dos virus de animais que son comparables aos que se utilizan cos bacteriófagos. Tamén se utilizan cultivos celulares no proceso de proba de novos medicamentos e substancias, e está a substituír o emprego de animais vivos. Actualmente tamén se está a experimentar con cultivos celulares para o seu emprego, por exemplo, en transplantes de pel. Os cultivos celulares utilízanse industrialmente na produción de proteínas recombinantes que non poden ser sintetizadas nos sistemas de produción microbianos (bacterias, mofos ou fermentos): anticorpos monoclonais, hormonas, encimas, vacinas víricas, etc. Os cultivos celulares son bastante inestables. Así, os cultivos primarios poden morrer ao repetir o cultivo ou dar orixe a cepas celulares alteradas, pero aínda diploides. Estas, pola súa vez, morrerán tamén, a non ser que dean orixe a estirpes celulares alteradas de forma máis radical pero permanentes. Todos estes tipos de cultivos son valiosos para os estudos de viroloxía, tamén para os de fisioloxía e xenética celular. Cultivos primarios e secundarios. Para reproducir células animais sepárase un fragmento de tecido nos seus compoñentes celulares con axuda de tripsina. Despois de extraer esta, a suspensión colócase nun recipiente de vidro ou de plástico de fondo plano (unha placa de Petri ou un tubo de ensaio), xunto cun medio líquido (o ideado por Eagle é amplamente utilizado) que contén os ións necesarios a 76

72 OS AXENTES BIOLÓxICOS concentracións isosmóticas, aminoácidos e vitaminas e soro animal nunha proporción que varía entre unha escasa porcentaxe e o 50%. O bicarbonato adoita empregarse como un tampón en equilibrio co CO 2 do aire situado por enriba do medio. Despois dun tempo variable de latencia, as células únense e esténdense no fondo do recipiente, e logo empezan a dividirse mitoticamente, dando lugar a un cultivo primario. A unión a un soporte ríxido é esencial para o crecemento da maioría das células normais, o que se coñece como dependencia de ancoraxe. Nos cultivos primarios, as células conservan algunhas das características dos tecidos dos que derivan e son principalmente de dous tipos: delgadas e elongadas (pseudofibroblastos) ou poligonais e tendentes a formar sabas (pseudoepitelio). Ademais, algunhas células teñen bordos redondeados, semellantes ás células epiteliais, pero non forman sabas (células epitelioides). As células que se multiplican recobren o fondo do recipiente cunha capa continua e delgada, formada, a miúdo, por un grosor dunha soa célula (cultivos monocapa); se son fibroblásticas, están orientadas regularmente paralelas unha a outra. Os cultivos de células primarias obtidas a partir de tecidos cancerosos difiren dos das células normais e son parecidos ás células transformadas. Os cultivos consérvanse cambiando o líquido 2 ou 3 veces por semana. Cando os cultivos presentan un amoreamento excesivo, as células poden desprenderse da parede do recipiente mediante tripsina ou o produto quelante EDTA, e cunha fracción destas inícianse novos cultivos secundarios. Cepas e líneas celulares. As células procedentes de cultivos primarios poden transferirse, a miúdo, dun xeito seriado un determinado número de veces. Este proceso adoita provocar a selección dalgún tipo de célula, que se converte en predominante. As células poden continuar logo a multiplicación a unha taxa constante en moitas transferencias sucesivas, e do cultivo primario dise que se orixinou unha cepa celular (denominada cepa celular diploide), cunhas células que non presentan alteracións morfolóxicas nin de 77

73 OS AXENTES BIOLÓXICOS crecemento. Para iniciar un novo cultivo, as células deben ser transferidas en densidades relativamente elevadas. A pesar diso, as posibilidades de transferencia das cepas celulares é limitada; por exemplo, nos casos de células animais, o ritmo de crecemento diminúe ao cabo dunhas 50 duplicacións, rematando así o ciclo vital da cepa. Durante a multiplicación dunha cepa celular, algunhas células empezan a alterarse: adquiren unha morfoloxía distinta, crecen máis rapidamente e permiten iniciar un cultivo a partir dun inóculo menor. O clon derivado destas células, a diferenza da cepa celular que o orixinou, posúe un período vital ilimitado e recibe o nome de liña celular. As liñas celulares obtidas a partir de células normais presentan escasa densidade de saturación en condicións estándar (por exemplo, en presenza dun 10% de soro con cambios de medio de 2 a 3 veces por semana): as devanditas células crecen con rapidez para formar unha monocapa e, a continuación, o ritmo de crecemento diminúe considerablemente. Células transformadas. Os virus oncóxenos, as radiacións e certas substancias químicas poden causar cambios de tipo mutacional nas células cultivadas que afectan o seu crecemento e outras propiedades. Semellante transformación pode producirse tamén durante o crecemento seriado de liñas celulares sen exposición evidente a ningún axente. A radiación e as substancias químicas poden causar transformación, así como cancro in vivo, inducindo mutacións (mutacións somáticas, porque non existen células xerminais). De feito, Ames demostrou que a maioría das substancias químicas oncóxenas ou os seus derivados metabólicos son tamén mutáxenos. As células transformadas poden ter propiedades que non existen nas células sen transformar en repouso. Estas propiedades afectan: A. Comportamiento do cultivo: 1.- Aumento do grosor do cultivo. 2.- Orientación celular ao chou. 3.- Aumento da densidade de saturación. 78

74 OS AXENTES BIOLÓxICOS 4.- Diminución da necesidade do soro. 5.- Aumento da eficacia de formación de clon. 6.- Aumento da melladura e refractividade marxinal. 7.- Diminución da dependencia de ancoraxe. B. Superficie celular. (...) C. Características bioquímicas. (...) D. Outras características: 1.- Produción de tumor por 10 6 ou menos células inoculadas por vía subcutánea en animais inmunoloxicamente aceptantes. 2.- Formación de anormalidades cromosómicas. 3.- Ausencia de envellecemiento. Todos os tipos de cultivos de células animais que vimos atoparon aplicación en viroloxía. A elección da especie e do tecido de orixe, así como do tipo de cultivo (primario, cepa celular ou liña celular), depende do virus e dos obxectivos experimentais. Na táboa 3 indícanse a orixe e as características das liñas celulares máis utilizadas. Na produción de vacinas víricas para o seu emprego na especie humana non se utilizan liñas celulares permanentes, xa que son parecidas ás células malignas tanto no que respecta ao seu tipo de cultivo como ao seu aneuploidía, polo que é posible que os virus propagados nas devanditas liñas puidesen adquirir determinantes xenéticos de tipo maligno. Por outra parte, os cultivos primarios ou as cepas celulares diploides utilizadas conteñen a miúdo certo número de virus latentes, que poden constituír tamén unha ameaza para a saúde. Son exemplos da introdución de axentes biolóxicos por manipulación de cultivos celulares a infección por virus de Marburg (grupo 4) que, en 1967, afectou persoal de laboratorio que manipulaba tecidos de mono verde africano. Tamén os casos de infección polo virus B ou herpes virus simiae (grupo 3) aumentaron coa manipulación de monos e uso de células renais procedentes destes animais. Andrup et alii (1990), nunha revisión sobre a bioseguridade nas industrias que utilizan métodos de produción baseados 79

75 OS AXENTES BIOLÓXICOS no uso de ADN recombinante, sinalan unha serie de posibles riscos asociados ao uso dos cultivos celulares de mamíferos. Este tipo de células, debido aos seus esixentes requirimentos, son inviables fóra do recipiente de cultivo e non supoñen un perigo por si mesmas, non obstante, poderían levar consigo riscos asociados á liberación de axentes activos ou de compoñentes das células. Estes axentes, como virus ou micoplasmas que infectan as células, poderían ser infectivos para o traballador se conseguisen escapar do sistema. Tamén, no caso da utilización de sistemas de ADN recombinante, os vectores de expresión (virus) empregados para a introdución destes fragmentos de ADN poderían causar infeccións no home. Este risco vese mitigado polo emprego de vectores que, polas modificacións sufridas, son incapaces de completar o seu ciclo vital fóra do recipiente de contención. Non obstante, nestes casos a propagación podería producirse coa participación dun virus auxiliar que suple as deficiencias que presenta o vector. Outro risco asociado co manexo dos cultivos celulares sería, segundo os mesmos autores, a produción de tumores nos traballadores. Estes tumores poderían producirse pola presenza (a propósito ou accidentalmente) de secuencias xenéticas que lles confiren ás células unha capacidade de crecemento inmortal, como no caso das liñas celulares continuas, e que talvez poderían ter capacidade carcinoxénica. Tamén se poderían producir tumores nas persoas que manexan as liñas celulares transformadas a través do contacto con proteínas con poder transformante ou pola exposición ao ADN proveniente de células con oncoxenes. 80

76 OS AXENTES BIOLÓxICOS Resumo das características dos distintos tipos de cultivos celulares TIPO DE CULTIVO CELULAR CULTIVOS PRIMARIOS E SECUNDARIOS CEPAS CELULARES LIÑAS CELULARES CÉLULAS TRANSFORMADAS CARACTERÍSTICAS - conservan características dos tecidos - pódense transferir varias veces - crecemento en monocapa - dependencia de ancoraxe - selección dun tipo celular - sen alteracións morfolóxicas - sen alteración de crecemento - transferencias limitadas (~50 duplicacións) - crecemento en monocapa - dependencia ancoraxe - alteracións morfolóxicas - medran máis rapidamente - período vital ilimitado - crecemento en monocapa - dependencia de ancoraxe - células que sufriron mutación - aumento do grosor de cultivo - orientación celular ao chou - aumenta a densidade de saturación - diminúe a necesidade de soro - maior eficacia de formación de clon - diminúe a dependencia ancoraxe 81

77 OS AXENTES BIOLÓXICOS TÁBOA 3. Liñas celulares máis utilizadas en viroloxía Nome da liña celular Especie de orixe Tecido de orixe Morfo. 1 Ploidia 2 Nº modal Marcadores HeLa Detroit-6 Minnesota-EE L-132 Intestino 407 Fígado Chang KB Detroit-98 AV 3 Hep-2 J-111 WISH LLC-MK 2 BS-C-1 HaK BHK B14-FAF-G3 Don CHO L Rato NCTC, clona 929 Rato NCTC, clona Rato NCTC, clona Rato CCRF S-180 II Rato 3T3 Rato Humana Humana Humana Humana Humana Humana Humana Humana Humana Humana Humana Humana Mono 4 Mono 5 Hámster sirio 6 Hámster sirio Hámster chinés 7 Hámster chinés 7 Hámster chinés Carcinoma de cérvix Médula ósea esternal Epitelio esofáxico Pulmón embrionario Intestino embrionario Fígado Carcinoma oral Médula ósea esternal Amnios Carcinoma de larinxe Sangue periférico 3 Amnios Ril Ril Ril Ril Células peritoneais Pulmón Ovario Tecido conectivo Tecido conectivo Tecido conectivo Tecido conectivo Sarcoma 180 Tecido conectivo Epi Epi Epi Epi Epi Epi Epi Epi Epi Epi Epi Epi Epi Epi Epi Fib Fib Fib Fib Fib Fib Fib Fib Fib Fib Aneu Aneu Aneu Aneu Aneu Aneu Aneu Aneu Aneu Aneu Aneu Aneu Aneu Quasidip Aneu Eu Quasidip Eu Quasidip Aneu Aneu Aneu Aneu Aneu Aneu , Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí A maioría destas estirpes celulares foron certificadas polo Cell Culture Collection Committee e a American Type Tissue Culture Collection mantenas conxeladas. 1 Fib = tipo fibroblasto; Epi = tipo epitelial. 2 Anea = aneuploide; eu = euploide; quasidip = quasidiploide. 3 Leucemia monocítica. 4 Macaca mulatta. 5 Cercopithecus aethiops. 6 Mesocricetus auratus. 7 Cricetulus greiseus. Dulbecco, R. e Ginsberg, H. S. (1984a). 82

78 RELACIÓN PARASITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS

79 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS Ao longo de toda a súa vida, o home entra en contacto cun enorme número de axentes biolóxicos. Dende o mesmo momento do nacemento, diversas especies bacterianas comezan a se establecer de modo máis ou menos permanente sobre as superficies corporais. Non obstante, mentres que unhas bacterias non adoitan producir enfermidades e viven sobre a superficie corporal externa ou nas mucosas sen producir dano, formando parte do que se coñece como flora microbiana normal, outras, as patóxenas, cando infectan, producen case sempre enfermidade. Sobre a pel habitan fundamentalmente coco aerobios gram positivos (Staphylococcus epiderme, micrococo) e corinebacterias anaerobias e, en menor medida, corinebacterias aerobias, Staphylococcus aureus e estreptococos non hemolíticos. Logo do nacemento, as bacterias aséntanse sobre a superficie corporal, pero tamén se introducen rapidamente na cavidade oral a través da comida e outros contactos. Aos poucos días obsérvanse na boca poboacións de Streptococcus salivarius e, coa erupción dos dentes, aséntanse S. sanguis, S. mutans e outras especies anaerobias. Na farinxe aparecen Streptococcus viridians, estafilococos e Neisseria catarrhalis. No nariz, estafilococos e corinebacterias. Nos primeiros lanuxes do intestino delgado predominan as bacterias gram positivas, principalmente lactobacilos e enterococos (Streptococcus faecalis) e en zonas máis distais aparecen anaerobios e bacterias coliformes. Cronoloxicamente, as enterobacterias (coliformes), os micrococos e os estreptococos son as primeiras bacterias que aparecen nas feces logo do nacemento. Aos poucos días predominan os lactobacilos (bifidobacterias), especialmente nos nenos criados a peito. Coa liberización da dieta adquiren maior importancia as enterobacterias gram negativas, os bacteroides, os enterococos e os clostridios. Nas feces dos adultos aparecen, sobre todo, bacteroides e bifidobacterias. Na táboa 4 indícanse as principais bacterias que forman parte da flora bacteriana normal en diferentes superficies corporais. 85

80 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS Ademais de bacterias, sobre a pel e as mucosas tamén poden habitar determinadas especies de protozoos e fermentos. O complexo equilibrio existente entre a flora microbiana normal e o home só rompe ocasionalmente cando as defensas naturais do hospedador se encontran seriamente alteradas. Cando isto sucede, estes microorganismos, que, en situacións normais, serían incapaces de atravesar as defensas naturais do organismo, poden chegar a producir enfermidades. TÁBOA 4. Baterias máis frecuentes Nas superficies do corpo humano Bacteria Pel Conxuntiva Nariz Farinxe Boca Intestino Xenitais Vaxina Groso Externos Estafilococo + ± + ± ± ± ± + Neumococo ± ± + + Estreptococo viridans ± ± hemolítico ß ± ± fecal ± ± anaerobio ± Neisserias ± + + ± + ± Veillonellas ± + ± + Lactobacilos Corinebacterias Clostridios ± + ± Bacilos hemófilos Bacilos intestinais ± Bacterioides Micobacterias + ± ± + + Actinomicetos + Espiroquetas Micoplasmas ±* + + frecuente ± raro * prevalencia relacionada á actividade sexual Tomado de Sonnenwirth et alii (1984) 86

81 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS Estas bacterias autóctonas ou indíxenas, que así se chaman as que constitúen a flora bacteriana normal, son moi beneficiosas para o home. Interveñen de modo fundamental na prevención de determinadas enfermidades bacterianas pois, como veremos máis adiante, forman parte da primeira barreira de defensa do organismo fronte á invasión de axentes biolóxicos: barreira da pel e das mucosas. Mediante unha serie de mecanismos que se coñecen como antagonismo microbiano, impiden ou dificultan a colonización das mucosas ou da pel por parte de bacterias que poderían resultar patóxenas. No antagonismo microbiano inflúen mecanismos como a competencia polos nutrientes, alteracións no ph ou no potencial de oxidorredución, a acumulación de ácidos orgánicos ou a produción de substancias inhibidoras. A importancia desta barreira de defensa apréciase claramente nos individuos sometidos a un tratamento prolongado con antibióticos. Estes tratamentos eliminan gran parte da flora bacteriana normal, posibilitando que determinados axentes resistentes poidan medrar e causar lesións, como as producidas por Candida albicans cando é eliminada a flora oral, ou enterites graves, ocasionadas por Staphylococcus ou Clostridium difficile cando se reduce a flora intestinal. Tamén se comprobou que a redución ou eliminación da flora intestinal normal diminúe a dose infectiva mínima necesaria para que un patóxeno intestinal poida producir unha infección. Outras accións positivas dos microorganismos autóctonos teñen que ver coa síntese de nutrientes esenciais. Os coliformes, por exemplo, sintetizan a vitamina K. Tamén sabe que as bacterias intestinais subministran varias vitaminas hidrosolubles: biotina, riboflavina (vitamina B 2 ), ácido pantoténico e piridoxina (vitamina B 6 ). Co maior coñecemento que temos sobre os beneficios que achega a flora microbiana normal disparouse o interese por este tipo de microorganismos. Este interese recolleuno a industria alimentaria que actualmente fabrica e publicita produtos nos que algunhas especies de bacterias, 87

82 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS constituíntes habituais da flora intestinal, entran a formar parte da súa composición, ou aos que se lles engaden substancias que favorecen o crecemento deste tipo de microorganismos. A finalidade destes alimentos é contribuír a restituír a flora bacteriana normal cos conseguintes beneficios que iso reporta. Talvez o exemplo máis notable destes alimentos con actividade biolóxica o constitúen os iogures aos que, aínda que xa conteñen as bacterias lácticas (Lactobacillus casei e Streptococcus cremoris) que interveñen no proceso de fermentación, se lles engaden outros lactobacilos acidófilos e bifidobacterias. En canto aos efectos prexudiciais da flora normal bacteriana hai que sinalar que, nalgúns casos, pode permitir o crecemento dalgunhas bacterias patóxenas en tecidos que, doutro modo, non permitirían o seu crecemento. Este sinerxismo bacteriano pódese dar, por exemplo, pola produción de metabolitos específicos que serven de alimentación cruzada entre certas bacterias. Tamén a protección que reciben os gonococos, na uretra, fronte á acción da penicilina polos estafilococos produtores de penicilinasa, constitúe outro caso de sinerxismo Así mesmo, crese que a presenza de bacterias gram negativas no intestino inflúe sobre a sensibilidade do hospedador ás endotoxinas. Os antíxenos endotoxínicos derivados das bacterias gram negativas da flora intestinal contribúen á hipersensibilidade que manifestan moitos individuos. Finalmente, naquelas situacións que provocan unha diminución xeral de resistencia (lesións por radiación, tratamento prolongado con corticosteroides, situacións de malnutrición grave ou debilitamento xeral por efecto doutras enfermidades) poden producirse infeccións bacterianas endóxenas nas que as bacterias da flora residente se converten en patóxenos oportunistas. Tamén, no ámbito local, cando os tecidos sofren danos que destrúen a súa integridade (extracción dental, feridas, queimaduras, etc.) as bacterias autóctonas poden penetrar en tecidos máis profundos e producir infeccións destes tecidos ou mesmo bacteriemias. 88

83 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS Sucede isto, por exemplo, con Streptococcus mitis e S. salivarius que, logo dunha extracción dental ou dunha amigdalectomía, poden producir unha bacteriemia transitoria. PATOXENICIDADE: INFECCIÓN E ENFERMIDADE Como vimos, a capacidade das bacterias para producir enfermidades, é dicir, a súa patoxenicidade varía enormemente dunha especie a outra. Das que infectan os seres humanos pouco despois do nacemento a maioría son comensais non patóxenos, que non poden atravesar as defensas naturais do hospedador, a non ser que estean seriamente alteradas. Outras poden coexistir co hospedador nunha tregua que só se rompe ocasionalmente. Pola contra, os patóxenos altamente virulentos producen, xeralmente ou sempre, enfermidade cando infectan. De entre estes patóxenos, algúns (por exemplo, os bacilos da peste, a tularemia ou o ántrax) están só presentes durante a enfermidade activa. Outros, como por exemplo, os bacilos tíficos, os bacilos diftéricos ou as rickettsias adoitan ser eliminados logo de causar unha enfermidade aguda, pero nalgúns casos poden persistir, logo da recuperación, nos portadores sans. En consecuencia, aínda cando os dous termos se utilizan con frecuencia como sinónimos, a distinción entre infección e enfermidade é fundamental. Unha alteración discreta da resistencia do hospedador despraza o precario equilibrio existente cos patóxenos leves, en tanto que unha alteración grave permite mesmo que se convertan en invasores os clásicos xermes non patóxenos. Estas infeccións que suceden só cando se produce un debilitamento das defensas do hospedador denomínanse infeccións oportunistas. Tales infeccións oportunistas fixéronse máis frecuentes como consecuencia dos avances terapéuticos: o emprego de fármacos citotóxicos e as radiacións (deprimen a medula ósea e a linfopoese); os tratamentos con corticoides (eliminan certos linfocitos asociados ao timo e deprime a resposta inflamatoria); a utilización de antibióticos (diminúen a resistencia aos microorganismos 89

84 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS ao inhibir a flora normal competitiva existente na superficie do organismo e na mucosa (antagonismo microbiano). A virulencia, termo que fai referencia ao grao de patoxenicidade, emprégase para comprender dous trazos dun organismo patóxeno: a súa infectividade ou capacidade para colonizar un hospedador e a gravidade da enfermidade producida. A virulencia varía non só entre as especies bacterianas senón tamén entre as cepas. Os factores de virulencia son aqueles compoñentes dun microorganismo cuxa perda (xeralmente por mutación) altera especificamente a virulencia deste, sen afectar a súa viabilidade. As dúas clases principais de factores de virulencia son as toxinas e as moléculas de superficie. Estas últimas actúan de dúas maneiras diferentes: favorecendo a resistencia á fagocitose e, especialmente no caso dos virus, facilitando a adherencia ás células sensibles. Cando se queren realizar estudos epidemiolóxicos e patoxénicos a miúdo, é importante valorar cuantitativamente a virulencia dunha cepa bacteriana. Para iso han de terse en conta a vía de inoculación, a especie animal sometida a proba, o seu estado fisiolóxico (idade, nutrición, ausencia doutra enfermidade, experiencia inmunolóxica), o medio de cultivo e a fase de desenvolvemento do cultivo inoculado. A virulencia dun organismo ou dunha toxina exprésase xeralmente como a DL 50 (dose letal 50), é dicir, a dose que matará o 50% dos animais inoculados dentro dun tempo dado. Unha das substancias que lles confire maior virulencia ás bacterias son as exotoxinas que son encimas de acción extracelular. As exotoxinas de Clostridium tetani, Clostridium botulinum e Shigella dysenteriae, todos eles coa notación T (produción de toxinas) no anexo II do Real decreto 664/1997, son os tres velenos máis potentes que se coñecen. Un nanogramo (10-9 g) de toxina tetánica ou botulínica é suficiente para matar a unha cobaia (táboa 5). Estas dúas toxinas actúan bloqueando selectivamente certos tipos de terminais presinápticos do sistema nervioso central. 90

85 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS Para que un microorganismo sexa patóxeno, ademais de virulento, ten que ser transmisible. A transmisibilidade dunha cepa bacteriana fai referencia á súa capacidade para causar unha infección demostrable nun hóspede animal determinado. A dose requirida para que se produza a infección coñécese como a DI 50 (dose infecciosa no 50% dos animais). Aínda que os axentes patóxenos, cando infectan, case sempre producen enfermidade, nalgunhas ocasións a virulencia do microorganismo non se manifesta. Sucede neste caso que se producen infeccións bacterianas ocultas. Estas infeccións inaparentes poden ser de dous tipos: infeccións dormentes ou infeccións latentes. Considéranse dormente aquelas infeccións nas que é posible recuperar os xermes a partir de determinadas mostras do individuo infectado (esputos, sangue, feces, etc.). As infeccións latentes serían aquelas nas que os xermes non poden ser recuperados polos métodos dispoñibles, pero si pode inferirse a súa presenza de forma indirecta mediante, por exemplo, probas inmunolóxicas. Nas infeccións dormentes aplícase o termo portador a aquelas persoas que poden continuar difundindo o microorganismo logo da súa recuperación. En condicións epidémicas, a taxa de portadores pode chegar ata o 100%, posiblemente a causa das continuas reinfeccións. O estado portador adoita ser temporal, persistindo un tempo limitado despois da infección, para desaparecer despois. Non obstante, despois dalgunhas enfermidades como a febre tifoidea, causada por Salmonella Typhi, algúns individuos poden seguir sendo portadores indefinidamente. S. Typhi pode persistir nas vías biliares despois da salmonelose activa, chegando a establecer un estado de portador crónico, con excreción continua nas feces (10 6 a 10 9 bacterias por gramo de feces). 91

86 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS TÁBOA 5. Exotoxinas producidas polas principais bacterias toxixénicas patóxenas para o home Especies bacterianas Clostridium botulinum Clostridium tetani Clostridium perfringens Clostridium septicum Clostridium novy Corynebacterium diphtheriae Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Pasteurella pestis Bordetella pertussis Enfermidade Shigella dysenteriae Botulismo Vibrio cholerae Tétano Cepas de Escherichia coli Gangrena gaseosa Gangrena gaseosa Gangrena gaseosa Difteria Infeccións pióxenas Infeccións pióxenas e escarlatina Peste * DL 50 kg indica a dose letal media (DL 50 ) por quilogramo de cobaia (C), rato (R) ou coello (Cn). ** A designación das toxinas con letras gregas é só arbitraria e baséase na orde na que foron identificadas. Modificado de Van Heyningen, W.E.: En General Pathology, páx. 754 (H.W. Florev. dir.). Saunders Filadelfia Wood, W. B. e Davis, B.D. (1984) Tose ferina Disentería Cólera Gastroenterite Toxina Seis neurotoxinas tipospecíficas Tetanoplasmina Tetanolisina Toxina α** Toxina β Toxina γ Toxina δ Toxina ε Toxina η Toxina θ Toxina ι Toxina χ Toxina λ Toxina α Toxina α Toxina β Toxina γ Toxina δ Toxina ε Toxina ξ Toxina diftérica Toxina α Enterotoxina Leucocidina Toxina β Toxina γ Toxina δ Estreptolisina Ο Estreptolisina S Toxina eritrogénica DPNasa-estreptocócica 92

87 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS As infeccións latentes son recoñecidas de dúas maneiras: retrospectivamente, a través da emerxencia posterior da enfermidade declarada, ou ben concorrentemente, a través da presenza de reactividade inmunolóxica. Na infección por bacilo de Koch ( Mycobacterium tuberculosis) non tratada, a proba da tuberculina permanece case sempre positiva e a enfermidade actívase ocasionalmente moitos anos máis tarde. No caso daqueles traballadores con risco de exposición a axentes biolóxicos que causan enfermidades que presentan un longo período de latencia, o historial médico débese conservar entre 10 e 40 anos despois de finalizada a posible exposición, en consonancia co art. 9.3.d do Real decreto 664/1997. Ademais, nestes casos, a vixilancia da saúde debe ir máis alá da finalización da relación laboral, art. 8.6 do Real decreto 664/1997 e art do Real decreto 39/1997. VÍAS DE ENTRADA DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Moitos dos procesos propios dos sectores de actividade nos que os contaminantes biolóxicos están presentes son susceptibles de producir po e aerosois aos que, habitualmente, irán asociados os microorganismos. A exposición e subseguinte infección dun individuo por un axente biolóxico pode ter lugar por varias vías: respiratoria (inhalación) parenteral (pincaduras, lesións ou roturas da pel) dérmica (a través de excoriacións da pel e microferidas, en ocasións inapreciables) oral (inxestión) ocular (a través da conxuntiva) A principal vía de entrada de axentes biolóxicos é a vía respiratoria. Por esta vía penetran os axentes e os seus produtos que se atopan en forma de bioaerosois. Hai que ter en conta que o aire é o medio de propagación e diseminación de numerosos axentes biolóxicos. A localización dos microorganismos no tracto respiratorio vai depender do tamaño do bioaerosol do que forman parte. Non obstante, adoitan 93

88 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS alcanzar doadamente as vías respiratorias inferiores, pois unha gran proporción de bioaerosois forma parte da fracción respirable. Os materiais que se atopan aerosolizados poden alcanzar a pel e os ollos, pero o principal risco está na inhalación. As partículas incluídas na fracción inhalada, que comprende todos os aerosois que penetran no tracto respiratorio, vanse depositando en diferentes rexións deste. As partículas de maior tamaño (>10 µm), fracción torácica, quedan retidas no primeiro tramo do sistema respiratorio, rexión nasofarínxea, mentres que outras avanzan ata quedar retidas na árbore bronquial (traquea, bronquios e bronquíolos), ou ata chegar á rexión pulmonar (alvéolos), constituíndo a fracción respirable. Como se verá máis adiante, algúns dos mostradores para bioaerosois que existen permiten clasificar os organismos en función do seu tamaño, co que nos dá unha valiosa información sobre o lugar en que teoricamente se van depositar. A vía parenteral é fundamental na transmisión dos parasitos sanguíneos (hepatite B, VIH, leishmanias, etc.). Estes parasitos penetran no organismo cando se producen picaduras con agullas ou cortes con materiais contaminados. Algúns deles necesitan da mediación de vectores artrópodos que inoculan o axente directamente no sistema circulatorio. A transmisión por vía dérmica ten lugar cando o individuo se infecta polo contacto con materiais contaminados. A pel intacta proporciona unha defensa efectiva contra a maioría dos microorganismos, pero, cando se atopa danada, convértese nunha importante vía de entrada se se produce contacto co axente infeccioso a través de fluídos biolóxicos ou materiais contaminados. A vía oral non debería supoñer un risco importante para a saúde dos traballadores se se respectan as normas de correcta hixiene. É unha vía de entrada moi importante pola inxestión de alimentos contaminados, o que non é directamente un risco profesional. 94

89 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS Por último, certos axentes biolóxicos poden introducirse a través das membranas mucosas, tamén a conxuntiva, ás que chegan a través do aire (bioaerosois) ou por contacto, por exemplo, ao fregar os ollos coas mans contaminadas. As doses infeciosas para o home varían co axente biolóxico, a vía de entrada e a resistencia do hospedador, é dicir, o grao de integridade dos seus sistemas defensivos. Os axentes biolóxicos dentro do ambiente laboral poden atoparse en diferentes medios: auga, aire, chan, animais e materias primas. A auga A auga xoga un papel importante dentro do ambiente laboral como vía de transmisión de axentes infecciosos e parasitarios, fundamentalmente intestinais, e que van ter acceso dende este medio ao organismo humano, principalmente, por un proceso de inxestión. Existe unha ampla lista de enfermidades susceptibles de ser transmitidas pola auga, as cales, poden ter diferentes orixes. Entre elas destacan: Bacterianas: Virais: Amebiases: Helmintiases: Fúnxicas: febres tifoidea e paratifoidea, disentería, tuberculose, diarreas, ictericia hemorráxica, colibacilose, septicemia hemorráxica, tularemia,... hepatite A, poliomielite, meninxite linfocitarias,... disentería amebiana, algunha meningoencefalite, diarreas,... anquilostomiase, esquistosomiase, cistes hidatídicos,... dermatofitose O risco de transmisión de cada unha delas dependerá da natureza da contaminación da auga, así coma do uso da mesma nunha determinada actividade laboral. Así, a auga 95

90 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS pode ser utilizada a partir da rede para a bebida e para a limpeza, derivándose destas utilizacións uns riscos de carácter xeral, comúns a calquera industria. Atendendo á orixe da auga que se está a utilizar para estes fins, deberá establecerse un programa de vixilancia da potabilidade. Outro punto de contacto do traballador con este medio pode darse en determinadas fases dun proceso industrial. Neste caso, a auga ou se utiliza xa contaminada ou ben a contaminación se produce a consecuencia deste proceso, ao facilitarse o desenvolvemento dos axentes patóxenos en determinadas condicións: temperatura, ph, adición de substancias que poden actuar como nutrientes, etc. Particularmente importante é o papel da auga como vía de transmisión de enfermidades parasitarias en determinados traballos agrícolas, sobre todo en zonas subdesenvolvidas, así como para os traballadores que, dalgunha forma, entran en contacto con augas residuais (poceiros ou o persoal de plantas de tratamento de augas residuais). O aire O aire, polo xeral, non é un medio axeitado para o desenvolvemento dos microorganismos. Aqueles que se atopan no aire poden proceder do chan, auga, plantas, animais ou outras fontes, dependendo do ámbito de que se trate. Os microorganismos no aire vanse atopar adheridos a pequenas partículas de po ou a pinguiñas de auga. Polo tanto, a transmisión do axente a través do aire vai estar relacionada cos niveis de materia particulada, así como coa posible xeración de bioaerosois infectivos. A característica xeral dos microorganismos transmitidos polo aire é a súa resistencia á sequidade, utilizando esta vía de transmisión os patóxenos respiratorios, que penetran no organismo humano principalmente por un proceso de inhalación. Un risco biolóxico de carácter xeral transmitido polo aire é o que se deriva das instalacións de aire acondicionado, que 96

91 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS poden actuar como medio de propagación de determinados microorganismos e que son responsables de dous tipos de afeccións: 1.- Enfermidades infecciosas: lexionelose, ornitose. 2.- Enfermidades de tipo alérxico que afectan sobre todo ás vías respiratorias, a distintos niveis: rinite, asma, alveolite. No desarrollo destes trastornos están implicados fungos (Aspergillus spp., Penicillium spp), endotoxinas bacterianas e actinomicetos termofílicos. Estes últimos relacionados coa alveolite alérxica. O chan Dos traballos que poden supoñer unha manipulación do chan, como minería, agricultura, perforacións, etc., pódense derivar principalmente os seguintes riscos de carácter biolóxico: 1.- Enfermidades infecciosas: tétano, histoplasmose, coccidioidomicose. 2.- Enfermidades parasitarias: anquilostomiase, anguillulosia e ascariase, entre as máis frecuentes. Os ovos e formas infectivas dos axentes causais destas enfermidades soen estar presentes no chan procedentes principalmente das feces e dos ourinos doutros animais infectados. A vía de penetración destes axentes no organismo humano será por contacto ou inoculación. Non obstante, para precisar o risco biolóxico de traballos que supoñan un contacto co chan (minería, perforacións, agricultura, plantacións), hai que ter en conta a zona en que se realizan os traballos, as enfermidades endémicas desta zona. Os animais Os vertebrados superiores, actuando como animais domésticos ou vivindo en estado salvaxe, son axentes transmisores dunha serie de enfermidades que se coñecen co 97

92 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS nome de zoonose, e resulta un fenómeno raro que unha zoonose se transmita de persoa a persoa. Así pois, unha importante incidencia de zoonose darase nas persoas que traballen directamente con animais ou cos seus produtos, ou ben que compartan con estes un determinado ámbito no que poden existir, ademais, determinados invertebrados (insectos, carrachas, moluscos) que poden actuar como transmisores da enfermidade. Por outra banda, son moitos os invertebrados que interveñen como vehículos de transmisión de enfermidades, sexan ou non zoonose, ben tomando parte no ciclo biolóxico do parasito causante da enfermidade, actuando como hospedador intermediario, ou ben actuando como transmisores pasivos, como por exemplo, os insectos que poden transportar o parasito dende a auga, o chan ou dende outros animais, ata un novo hospedador, ou ben intervir na contaminación da auga ou dos alimentos. As materias primas As materias primas naturais que, ademais de que en si mesmas poden presentar un risco biolóxico, constitúen, en moitas ocasións, un medio axeitado para o desenvolvemento dos microorganismos. Pódense incluír neste grupo: materias primas da industria alimentaria (carne, peixe, froita, verdura, etc.); a maioría das materias primas utilizadas na industria téxtil (algodón, liño, cánabo, la, etc.), nas industrias de peles e curtidos, na de madeira e cortiza; os materiais orgánicos utilizados en laboratorios (de investigación, farmacéuticos, clínicos, etc.). Neste apartado poden incluírse, aínda que propiamente non son unha materia prima, os aceites utilizados como lubricantes e refrixerantes (fluídos de corte e taladrinas), xa que constitúen un excelente medio para o desenvolvemento de determinados microorganismos como mofos e fermentos (Fusarium, Cephalosporium e Candida) que son causas de afeccións dérmicas nas industrias siderometalúrxicas. 98

93 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS Nos depósitos de taladrinas con boa aireación (Laborda, R., 1993) existen bacterias do xénero Pseudomonas, principais responsables da súa degradación, así como coliformes. Woskie et alii (1996) atoparon que, nos traballos con metais nos que se manexan fluídos, as bacterias predominantes son do xénero Pseudomonas, con máis do 60% das colonias contadas, seguido dos xéneros Enterobacter e Bacillus. Tamén os niveis de endotoxinas bacterianas nestes ambientes laborais son elevados, asociados á presenza de bacterias mesófilas e gram negativas (Thorne et alii, 1996). En depósitos mal aireados aparecen microorganismos anaerobios do xénero Desulfovibrio que producen a redución de sulfatos a sulfuros xerando olores desagradables. Ademais tamén a bacteria Legionella, que pode crecer nas augas almacenadas previamente, na combinación cos fluídos de traballo con metais, podería contaminar os fluídos de corte diluídos. BARREIRAS DO ORGANISMO FRONTE Á INVASIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS. Despois de que Koch definise os criterios para poder considerar un microorganismo o axente etiolóxico dunha enfermidade (1), empezáronse a estudar as reaccións do hospedador fronte ás invasións bacterianas. A finais do século pasado, algúns autores defendían a existencia dunha inmunidade celular (Metchnikoff, 1882), mentres que outros defendían que eran as substancias bactericidas e antitoxinas do soro as responsables da resistencia do hospedador, é dicir, a inmunidade humoral. Sería no ano 1904 cando (1) Koch, despois de identificar o bacilo tuberculoso, formalizou os seguintes criterios para distinguir un axente patóxeno dun microbio accidental: 1) o organismo atópase sempre nas lesións da enfermidade; 2) pode ser illado en cultivos puros en medio artificial; 3) a inoculación destes cultivos orixina un proceso parecido nos animais de experimentación, e 4) o axente patóxeno pode recuperarse a partir das lesións producidas nestes animais. Estes criterios foron moi valiosos para identificar os axentes patóxenos, aínda que non todos eles se cumpren sempre: certos organismos, entre eles todos os virus, non crecen no medio artificial, e outros son patóxenos tan só para o home. 99

94 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS Neufeld e Rempau estableceron un papel conxunto para as dúas clases de factores. Observouse que os animais inxectados con pneumococos mortos contiñan anticorpos (Ac) no seu soro, chamados opsoninas, que aceleraban en gran medida a fagocitose in vitro dos mesmos organismos. Os vertebrados que se infectan cun parasito microbiano mostran unha resposta "inmune" específica, que contribúe tanto á súa recuperación da enfermidade coma a protexelos fronte a unha nova infección. A análise destas respostas deu lugar ao campo principal da inmunoloxía. A inmunidade ou resistencia fronte a unha enfermidade infecciosa depende non só de respostas inmunes específicas, senón tamén de factores inespecíficos, tales como os encimas que atacan os parasitos, as células fagocitarias especializadas en captalos e as diferenzas nos receptores da superficie celular para a adhesión e entrada dos virus e mesmo doutros parasitos maiores. O hospedador tense que defender constantemente da invasión de axentes biolóxicos. As diferenzas no conxunto xenético e o estado fisiolóxico do hóspede inflúen sobre os numerosos factores que contribúen a esta resistencia. Os microorganismos, para producir enfermidade no home, han de superar unha serie de barreiras de defensa. A primeira barreira é a constituída pola pel e as membranas mucosas. Cando esta barreira é superada, póñense en marcha complexos mecanismos de resposta celular e inmunolóxicos. BarreIras da pel e das mucosas. Factores mecánicos. A superficie intacta dunha epiderme sa rara vez é atravesada por bacterias, malia algúns parasitos poderen atravesala de forma activa, como por exemplo o Schistosoma spp. e Ancylostoma duodenale. Non obstante, cando a integridade da superficie epitelial está alterada (escoriacións ou microferidas), pode desenvolverse unha infección subcutánea, a miúdo causada polos estafilococos que normalmente habitan nos folículos pilosos e nas glándulas sudoríparas. As infeccións dérmicas son particular- 100

95 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS mente correntes cando a pel está húmida, como acontece nos climas cálidos e húmidos. Por outro lado, moitas bacterias patóxenas son capaces de atravesar as membranas mucosas nas superficies húmidas da cal se multiplican. Estas barreiras comprenden as conxuntivas e as superficies oral, respiratoria, gastrointestinal e xenitourinaria. Entre os factores mecánicos que axudan a protexer as superficies epiteliais figuran a acción de lavado dos líquidos fisiolóxicos (bágoas, saliva, ouriños), a retención polas capas mucosas, a eliminación polos cilios (no home a "escaleira móbil" ciliar dos bronquios e da traquea conduce a "manta" mucosa cara á farinxe a unha velocidade de 1-3 cm./h) e pola tose, os esbirros e a escamación. Non obstante, a protección ofrecida polas membranas mucosas é moi incompleta, especialmente cando a superficie se somete a tensión mecánica ou o epitelio sofre algunha lesión (extracción dental, esforzos ao defecar ou no parto). Nestes casos os xermes poden iniciar unha infección mesmo en puntos vulnerables distantes da zona de entrada. As defensas hísticas ocúpanse continuamente da eliminación de xermes de baixa patoxenicidade, así como ocasionalmente en combater os máis virulentos. Factores químicos. Os factores mecánicos por si sós non explican a notable resistencia da pel e das mucosas á invasión bacteriana. A acidez das secrecións gástricas mantén a habitual esterilidade do estómago. O baixo ph da pel (3 a 5) e da vaxina adulta (4 a 4,5), debida en parte aos produtos do metabolismo bacteriano, frea a proliferación de numerosos microorganismos. Os ácidos graxos insaturados da pel matan certas especies bacterianas patóxenas, como Streptococcus pyogenes, pero estimulan o crecemento doutras, como as difteroides. A selectividade destes procedementos pode explicar o feito de que habiten na pel tan poucas clases de bacterias. 101

96 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS O principal factor autoesterilizante das bágoas, secrecións nasais e saliva é a lisozima, e o do seme parece ser a espermina, que é bactericida para moitas bacterias patóxenas. As secrecións mucosas (p. e., do tracto respiratorio, a saliva, as bágoas) conteñen tamén anticorpos, especialmente do tipo IgA. O antagonismo microbiano pola flora normal suprime o crecemento de moitas bacterias e fungos potencialmente patóxenos en zonas superficiais, tanto mediante a competencia polos nutrientes esenciais como mediante a produción de substancias inhibidoras. Defensa fagocítica Cando as bacterias ou outros parasitos invasivos atravesan a pel ou as membranas mucosas, póñense en marcha complexos mecanismos de defensa celular. Os macrófagos e os leucocitos polimorfonucleares, os locais e os procedentes do sangue, acumúlanse arredor dos axentes invasores e inician o proceso fagocítico. A presenza dos microbios ou axentes estraños dan lugar a unha resposta inflamatoria que se caracteriza por unha dilatación dos vasos sanguíneos circundantes e o paso das células fagocíticas á zona afectada. Esta resposta fagocítica vese favorecida pola presenza de factores hísticos que, aínda que é un mecanismo molecular menos eficiente que o mediado por anticorpos, é esencial para a fagocitose por granulocitos ou monocitos. Defensa inmunolóxica Este tipo de resposta fronte á invasión do organismo por axentes estraños só se dá nos vertebrados. Comprende un conxunto de procesos mediante os que os animais forman proteínas (anticorpos) e células (linfocitos B e linfocitos T) especificamente reactivas, en resposta a unha gran variedade de moléculas. As respostas inmunes poden ser inducidas contra unha variedade case ilimitada de substancias, entre as que os antíxenos microbianos son só unha minoría. Este mecanismo de defensa constitúe o principal medio de loita 102

97 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS contra a infección por virus e bacterias patóxenos. A especificidade da defensa inmunolóxica é a que explica que un individuo poida presentar inmunidade específica que lle confire unha acción protectora contra aqueles axentes biolóxicos responsables de infeccións pasadas. Así mesmo, este mecanismo é o que permite que se poidan fabricar vacinas contra determinados axentes. DEPRESIÓN DA DEFENSA DO HOSPEDADOR A resistencia antibacteriana pode verse alterada por unha gran variedade de condicións. Os trastornos circulatorios, tanto locais (causantes de isquemia ou conxestión e edema) como xerais (como o shock) interfiren a miúdo na mobilización e funcionamento das células fagocíticas. A obstrución mecánica dos sistemas de drenaxe, como os tractos biliar e urinario, interfire coa circulación nos tecidos baixo presión e impide a limpeza do contido infectado do órgano. Un consumo excesivo de alcohol etílico diminúe tamén, segundo se comprobou experimentalmente, a resposta inflamatoria á infección bacteriana. O déficit nutricional, como queda ilustrado pola frecuencia histórica entre fame e peste, pode influír profundamente sobre a resistencia de grandes poboacións. Así, algunhas diarreas infecciosas, como o cólera (rotavirus), son frecuentemente mortais para os nativos de países subdesenvolvidos, pero rara vez o son para os visitantes occidentais. A dieta pode influír tamén sobre a resistencia, incluída a inmunidade, a través da súa acción sobre a flora gastrointestinal. As enfermidades debilitantes crónicas así como certas viroses agudas, (por exemplo, gripe) poden diminuír igualmente a inmunidade antibacteriana. Os factores hormonais son evidentes ante a frecuencia de enfermidades bacterianas, tanto agudas como crónicas, nos diabéticos e nos enfermos que reciben esteroides suprarrenais. Ademais, sábese que tanto a acidose diabética como as grandes doses de cortisona deprimen a resposta inflamatoria e que os altos niveis de glicosa nos exsudados agudos alteran a fagocitose. 103

98 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS A fatiga física e emocional e a exposición excesiva ao frío aumentan aparentemente a sensibilidade ás enfermidades bacterianas, especialmente do aparato respiratorio. Entre os mecanismos que se ven afectados inclúense a alteración dos reflexos de limpeza e de acción ciliar. O fumar tamén reduce considerablemente a acción ciliar. Outro dos factores que provoca unha depresión da defensa do hospedador son as anomalías do sistema inmunitario. TRANSMISIBILIDADE DAS INFECCIÓNS A incidencia dunha enfermidade é o número de casos novos por unidade de poboación e por unidade de tempo, mentres que a prevalencia é a fracción da poboación que está enferma nun momento dado. A incidencia depende da virulencia, comunicabilidade, frecuencia dos contactos e sensibilidade do hospedador. Unha enfermidade endémica ten unha incidencia máis ou menos constante. Unha epidemia é un pico na incidencia variable dunha enfermidade. Para ser naturalmente patóxeno, un microbio ten que ser transmisible a un individuo sensible; doutro xeito pode causar enfermidade só se é inoculado artificialmente. E, pola contra, as bacterias avirulentas poden ser altamente transmisibles. A transmisión do axente patóxeno pode ser directa, é dicir, de persoa a persoa, ou indirecta, coa intermediación de alimentos, obxectos ou vectores. Moitas bacterias transmítense dunha persoa a outra principalmente por contacto directo, na súa maior parte a través das mans, boca ou órganos sexuais. Algunhas enfermidades bacterianas, como a sífilis, víricas, como a rubéola, ou parasitarias, como a toxoplasmose, poden ser transmitidas por vía transplacentaria da nai ao feto. A transmisión indirecta ten lugar a través de diversas clases de axentes intermediarios. As infeccións entéricas transmítense a través da auga ou dos alimentos contaminados, 104

99 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS pero algúns virus presentan unha transmisión tanto entérica como respiratoria. As infeccións respiratorias son transmitidas á vez por contacto e por pinguiñas (aerosois) emitidas durante a tose, os esbirros ou ao falar. Nos laboratorios, a transmisión de numerosos axentes pódese producir por calquera procedemento que implique salpicadura, como soprar a última gota dunha pipeta, operacións de axitación e centrifugación, etc. Especialmente importante é a transmisión dos estafilococos polo po, concretamente pola roupa en xeral ou pola roupa de cama, que xunto cos libros, peites e outros obxectos que poden albergar os xermes, reciben o nome colectivo de fómites. Algúns axentes biolóxicos poden ser transmitidos por animais infectados que serven de reservorio. Outros transmítense a partir do leite (brucelose, tuberculose), reses mortas (ántrax, tularemia), auga de piscinas contaminadas (leptospirose) ou feridas. Os vectores artrópodos son o principal medio de transmisión das rickettsias, a excepción de Coxiella burnetii, e de certos virus dende un reservorio animal, a través dun ciclo infectivo. As pulgas son, por exemplo, as responsables de transmitir o axente infeccioso causante da peste (Yersinia pestis) dende a rata, o seu reservorio natural, ao home. Os tabáns, e tamén os ácaros, interveñen na transmisión de Francisella tularensis, causante da tularemia. As moscas poden transmitir tamén bacterias entéricas mecanicamente. Os artrópodos, fundamentalmente os mosquitos e, nalgúns casos, as carrachas, funcionan como vectores dos virus pertencentes ás familias Bunyaviridae, Flaviviridae e Togaviridae, pero nalgúns tamén poden servir como reservorios por transmisión transovárica. En relación cos endoparasitos, as moscas e os mosquitos son importantes vectores, ademais de hospedadores necesarios para pechar o ciclo biolóxico, de numerosos protozoos que causan importantes enfermidades como: malaria (Plasmodium spp), tripanosomiase (Trypanosoma spp) ou leishmaníase (Leishmania spp). As carrachas son vectores e reservorios de Babesia spp. 105

100 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS As infeccións por contacto poden ser, en gran parte, controladas pola hixiene persoal; e as infeccións transmitidas pola auga e os alimentos, mediante as correspondentes medidas hixiénicas. As infeccións transmitidas polo aire son as menos doadas de controlar. A súa difusión vese favorecida a través dos sistemas de calefacción e aire acondicionado dos edificios públicos que recirculan parte do aire interior repartíndoo polas diversas estancias. A transmisión eficiente dun axente infeccioso depende de diversos factores: 1.- A fonte do axente infeccioso. Cando este se atopa só en individuos enfermos ou convalecentes (por exemplo, varíola), as medidas de illamento son efectivas e é posible conseguir a erradicación total. Non obstante, en moitas enfermidades bacterianas (por exemplo, meninxite meningocócica), os portadores sans proporcionan un reservorio e serven de foco de infección en maior grao que os propios enfermos. Cando o reservorio natural é un hóspede animal ou o chan ou cando o xerme é un comensal humano amplamente difundido, que só ocasionalmente produce enfermidade (p. e., a maioría das bacterias que causan infeccións respiratorias), a súa erradicación é imposible. 2.- O número dos xermes liberados. Para que un axente infeccioso produza unha enfermidade é necesario un número mínimo de xermes, o que se coñece como dose infecciosa. Esta dose infecciosa, como xa se viu, depende de numerosos factores, entre os que cabe destacar a cepa do axente e o estado inmunolóxico do hospedador. O número de axentes liberados difiren moito nos diversos momentos ou fases da mesma enfermidade. Así, a peste bubónica, caracterizada por infeccións pechadas dos ganglios linfáticos e do torrente sanguíneo, é transmitida da rata ao home (polas pulgas), pero non de home a home. Non obstante, se está afectado o pulmón, as lesións abertas converten a enfermidade (peste pneumónica) en altamente contaxiosa. 3.- A conservación da virulencia durante o proceso de transmisión a un novo hospedador. A simple supervivencia 106

101 RELACIÓN PARÁSITO- HOSPEDADOR NAS INFECCIÓNS non garante a capacidade infecciosa dun axente biolóxico. Nun medio desfavorable o axente infeccioso pode sufrir unha serie de cambios que afectan a súa virulencia aínda que non destrúan a súa viabilidade. Por exemplo, Pasteur conseguiu fabricar unha vacina atenuada contra B. antracis tras cultivar os bacilos a temperaturas elevadas (42-43º C). As cepas así obtidas perden a súa virulencia, véndose considerablemente minguada a súa patoxenicidade. Nestas condicións, o hospedador elimina o axente infeccioso sen maiores complicacións. 4.- A frecuencia dos contactos efectivos entre individuos infectados e sensibles é un factor importante para a determinación da rapidez con que se estende a infección. A maior número de contactos existe maior probabilidade de contraer a infección. 107

102 ACTUACIÓN HIXIÉNICA

103 ACTUACIÓN HIXIÉNICA A Lei 31/1995, do 8 de novembro, de prevención de riscos laborais (transposición da Directiva marco 89/391 CEE), establece no seu artigo 16 que a acción preventiva das empresas a planificará o empresario a partir dunha avaliación inicial de riscos para a seguridade e saúde dos traballadores, que se realizará, con carácter xeral, tendo en conta a natureza da actividade e en relación con aqueles que estean expostos a riscos especiais. A devandita avaliación deberá ser actualizada cando cambien as condicións de traballo e, en todo caso, someterase a consideración e revisarase, se fose necesario, con ocasión dos danos para a saúde que se producisen nalgún traballador (art. 4.2, Real decreto 664/1997). Así mesmo, establécese a realización de controis periódicos das condicións de traballo e da actividade dos traballadores, cando fose necesario en función dos resultados da avaliación, para detectar situacións potencialmente perigosas. Tamén en función dos resultados desta avaliación, cando fose necesario, o empresario realizará as actividades de prevención, incluídas as relacionadas cos métodos de traballo e de produción que garantan un maior nivel de protección da seguridade e saúde dos traballadores. Estas actuacións deberán integrarse no conxunto das actividades da empresa e en todos os niveis xerárquicos desta. Sobre este aspecto de integración da actividade preventiva dentro do conxunto de actividades e decisións da empresa, tanto nos aspectos técnicos como organizativos, incide tamén o Real decreto 39/1997, polo que se aproba o Regulamento dos servizos de prevención (art. 1). Podemos definir a actuación hixiénica como un conxunto de accións destinadas, en primeiro lugar, a identificar os riscos que existen no posto de traballo para, a continuación, realizar a avaliación daqueles que non se poidan evitar co fin de dispoñer de información abonda que nos permita planificar unha acción preventiva que faga posible a redución da situación agresiva ata valores seguros. Logo, han de se establecer os oportunos controis periódicos que garantan que a situación segue sendo segura. 111

104 ACTUACIÓN HIXIÉNICA Na páxina seguinte esquematízase a actuación hixiénica fronte a un risco por axentes biolóxicos (figura 8). Figura 8.- Esquema de actuación hixiénica fronte a un risco por axentes biolóxicos AXENTES BIOLÓXICOS IDENTIFICACIÓN DO RISCO Información Observación Experiencia NON SE PODE EVITAR PÓDESE EVITAR PREVENCIÓN Foco Medio Receptor CONTROL PERIÓDICO EVALUACIÓN IDENTIFICACIÓN DE AXENTES Información Toma de mostras Método identificación EVITAR O RISCO RECURSOS Humanos Materiais Económicos PLANIFICACIÓN ACTIVIDADE PREVENTIVA MEDICIÓN Toma de mostras Método analítico CONTROL PERIÓDICO TEMPORIZACIÓN VALORACIÓN Criterios de valoración SITUACIÓN DE RISCO SITUACIÓN SEGURA Como se aprecia no esquema, o punto de partida é a identificación das situacións que poden entrañar risco para o traballador. Unha boa actuación hixiénica ciméntase nun bo coñecemento do posto de traballo. O labor do hixienista de campo comeza antes de acudir ao posto de traballo cunha boa documentación sobre a actividade da empresa e o proceso produtivo, o coñecemento das tarefas, axentes implicados nelas, as súas características, modo de transmisión, danos que produce, etc. Logo, no posto de traballo, é necesario obter a máxima información sobre o modo de traballo, os momentos de maior risco, o tempo dedicado ás tarefas de risco, o número de traballadores expostos, as 112

105 ACTUACIÓN HIXIÉNICA características destes traballadores, os equipos de traballo empregados, etc. Neste punto, a realización dunha boa enquisa hixiénica e a observación son fundamentais. A experiencia do hixienista fará o resto. Unha vez identificados os riscos é o momento de determinar cales poden evitarse e como (substitución do axente, illamento do proceso... ), e cales non. Para os riscos que non poden evitarse, procederase á súa avaliación. A avaliación de riscos laborais defínese (art. 3 do Real decreto 39/1997) como o proceso dirixido a estimar a magnitude daqueles riscos que non puidesen evitarse, obtendo a información necesaria para que o empresario estea en condicións de tomar unha decisión apropiada sobre a necesidade de adoptar medidas preventivas e, en tal caso, sobre o tipo de medidas que deben adoptarse. Para avaliar os riscos pode ser necesario tomar mostras que nos permitan identificar o tipo de axentes presentes no medio e/ou cuantificar o seu número. Non obstante, o máis habitual é que sexa posible realizar a valoración dos riscos sen necesidade de recorrer á toma de mostras, pasando directamente ao desenvolvemento da acción preventiva. Este caso dáse, por exemplo, cando os axentes biolóxicos implicados no proceso produtivo son ben coñecidos (manipulación intencionada) e a súa presenza no medio laboral está baixo control. Neste caso a mostraxe só tería sentido para comprobar a efectividade das medidas de contención aplicadas. Tampouco ten sentido realizar unha mostraxe naquelas situacións en que a presenza dos axentes no medio é ocasional e moi variable, como é o caso dos traballos en laboratorios ou das actividades con animais. Nestas actividades, nas que o risco de exposición se asocia a determinadas prácticas, tarefas e procedementos ou á presenza do axente en mostras ou materiais contaminados, debe pensarse que en calquera momento pode estar presente o dito axente e, en consecuencia, planificar as medidas preventivas para evitar a exposición do traballador. Mesmo naqueles casos en que puidese parecer que a toma de mostra é máis necesaria, por exemplo, nos lugares de traballo en que se manifesta a síndrome do edificio enfermo, o primei- 113

106 ACTUACIÓN HIXIÉNICA ro paso sería eliminar os focos evidentes de contaminación, comprobar que o sistema de climatización se atopa en perfecto estado con entradas e saídas de aire ben situadas e cun mantemento correcto, e realizar, se fose necesario, a súa limpeza e desinfección, en definitiva, establecer unhas condicións axeitadas e, só despois, no caso de que os problemas persistan, se xustificaría a toma de mostras. A decisión sobre a necesidade de realizar unha mostraxe ha de tomarse para cada caso concreto, atendendo ao tipo de actividade, os axentes biolóxicos implicados, os procedementos e organización do traballo, etc. Con toda a información dispoñible e os resultados das medicións, se os houbese, procederase á valoración de cada un dos riscos. Para o caso dos axentes biolóxicos non dispoñemos, xeralmente, de valores límite polo que, para valorar o risco, haberemos de recorrer a outros criterios que teñen en conta: as características do axente ou dos axentes implicados, o seu número, os danos que lle pode provocar ao traballador, as comparacións das concentracións dos axentes biolóxicos que aparecen no interior cos que aparecen no exterior, etc. Estes criterios de valoración analizaranse nun capítulo posterior. A valoración vainos servir para determinar se a situación é perigosa ou non. Os resultados da avaliación de riscos vannos servir tamén para priorizar as actuacións preventivas. Se a valoración nos indica que existe un risco para o traballador, procederase a planificar a acción preventiva, é dicir, deseñarase un plan no que se establezan as medidas que se deban adoptar e no que se prioricen e temporicen as actuacións que se van levar a cabo para conseguir a redución do risco ata valores seguros. A redución do risco pódese conseguir aplicando medidas que actúan sobre o foco, é dicir, sobre o lugar en que se orixina o risco. Estas medidas preventivas exercen a súa acción directamente sobre o axente biolóxico ou o seu reservorio, evitando que se transmita ao medio laboral. Outras medidas de prevención actúan sobre o medio, evitando a transmisión do axente biolóxico dende o foco ata o traballador. E, finalmente, existen outras 114

107 ACTUACIÓN HIXIÉNICA medidas que se aplican directamente sobre o receptor. Estas últimas utilizaranse sempre que sexa necesario, ben porque o risco non poida evitarse mediante medidas sobre o foco ou sobre o medio, ben porque é recomendable como práctica habitual (utilización de luvas, batas) ou porque así se estableceu especificamente en determinados protocolos de actuación, por exemplo, en caso de accidentes. Comprenden a utilización de roupa de protección e de equipos de protección individual. Na propia planificación preventiva deben especificarse os medios humanos e materiais necesarios, así como as necesidades económicas. As pautas para a realización da avaliación, así como o seu contido, tamén se indican no Real decreto 39/1997. A avaliación inicial dos riscos que non puidesen evitarse deberá estenderse a cada un dos postos de traballo da empresa en que concorran os devanditos riscos, tendo en conta as condicións de traballo existentes ou previstas e a posibilidade de que o traballador que o ocupe ou vaia ocupalo sexa especialmente sensible, polas súas características persoais ou estado biolóxico coñecido, a algunha das devanditas condicións. Do anteriormente exposto dedúcese que, como paso previo á avaliación de riscos, está a súa identificación e o establecemento de medidas para evitar aqueles que sexa posible. Só se procederá a avaliar aqueles riscos que non puidesen evitarse. Hai que lembrar neste punto que a Lei de prevención de riscos laborais establece entre os principios da acción preventiva, en primeiro lugar, evitar os riscos e, a continuación, avaliar os riscos que non se poidan evitar. O outro aspecto que hai que destacar do contido da avaliación de riscos é que establece como unidade de estudo o posto de traballo. Enténdese como tal o conxunto de operacións desenvolvidas por un traballador ao longo da xornada laboral, das máquinas, ferramentas, substancias, etc. que utiliza ou coas que se relaciona e das características do seu ámbito. Cada posto de traballo pódese referir a máis dun traballador se as características e os riscos son sensiblemente iguais. Ademais, ao realizar a avaliación de riscos, pódense establecer postos de traballo xenéricos, que incluirían os 115

108 ACTUACIÓN HIXIÉNICA riscos comúns dos traballadores da empresa ou dun sector grande desta. Non obstante, no establecemento destes postos de traballo xenéricos non debe obviarse a influencia das características individuais dos traballadores que, malia ser sempre relevante, o é moito máis no caso dos axentes biolóxicos. Algúns autores prefiren falar de grupos de exposición homoxénea, que comprenderían aqueles traballadores con idénticas probabilidades de exposición. Asumir esta uniformidade de exposición para un grupo de traballadores é unha práctica habitual na hixiene industrial, non obstante, comprobouse que a efectividade ao establecer estes grupos homoxéneos é moi variable, unhas veces por pasar desapercibidas diferenzas nas tarefas ou na prácticas de traballo, e outras, simplemente, por non ter un coñecemento rigoroso dos postos de traballo. Rappaport et alii (1993) comprobaron, aplicando a análise de varianza, que a maior parte da variación observada dentro dos grupos homoxéneos de exposición estaba ligada a características específicas do traballo, especialmente á mestura de tarefas e ás prácticas dos individuos que conforman o grupo. Dos case 200 grupos de exposición homoxénea analizados, catro de cada cinco non presentaban unha exposición uniforme. Os autores conclúen que as características, como o nome do traballo ou o lugar en que se realiza, utilizadas xeralmente para establecer os grupos homoxéneos de traballo, así como outras informacións manexadas como o tipo de contaminante, a natureza do proceso, o medio e a fonte de exposición, só representan unha pequena proporción da compoñente de varianza entre traballadores. Así pois, para establecer estes grupos homoxéneos de traballo débese realizar unha investigación previa, que comprenda unha observación rigorosa e, nalgúns casos, unha toma de mostras preliminar. Así mesmo, os grupos referiranse, necesariamente, a un número reducido de persoas, a aquelas que efectivamente presenten unha exposición homoxénea. Ademais da avaliación inicial, que se realiza con motivo da declaración de apertura ou pola iniciación dun programa de acción en materia de seguridade e saúde, a Lei de preven- 116

109 ACTUACIÓN HIXIÉNICA ción de riscos laborais e o Real decreto 39/1997, polo que se aproba o Regulamento dos servizos de prevención, establecen o que poderiamos denominar unha avaliación continua, pois regulan que se volverán a avaliar os postos con ocasión da elección de equipos de traballo, substancias ou preparados químicos, a introdución de novas tecnoloxías ou a modificación no acondicionamento dos lugares de traballo; o cambio nas condicións de traballo; ou a incorporación dun traballador cunhas características persoais ou estado biolóxico coñecido que o fagan especialmente sensible ás condicións do posto. A avaliación non é unha acción única que se realiza ao principio, cando decidimos levar a cabo a actividade preventiva, e que serve para coñecer a situación de partida sobre a que debemos actuar planificando unha serie de actividades, senón que debe ser un proceso continuo que se debe autovalorar e autocorrixir ao longo do tempo e que ha de servir para modificar, se é o caso, o conxunto das actividades de prevención se non se conseguen os obxectivos desexados. O artigo 6 do Real decreto 39/1997 establece que a avaliación inicial se revisará cando así o estableza unha disposición específica e, en todo caso, deberase revisar a avaliación correspondente a aqueles postos de traballo afectados cando se detecten danos para a saúde dos traballadores ou se aprecien, a través dos controis periódicos, que as actividades de prevención poden ser inadecuadas ou insuficientes, o que podemos considerar unha avaliación incidental. Tamén o Real decreto 664/1997, no seu artigo 4, incide sobre este aspecto. Estas características da avaliación de riscos laborais, así como o procedemento que se deba seguir, indicado no artigo 5 do Real decreto 39/1997, son plenamente aplicables ao caso dos axentes biolóxicos. Ademais, deben terse en conta as peculiaridades destes e o lexislado no Real decreto 664/1997 sobre a protección dos traballadores contra os riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos durante o traballo. Este Real decreto establece as disposicións mínimas 117

110 ACTUACIÓN HIXIÉNICA aplicables ás actividades nas que os traballadores estean ou poidan estar expostos a axentes biolóxicos debido á natureza da súa actividade laboral. A actuación hixiénica comprende os seguintes pasos: Identificación dos riscos laborais Avaliación de riscos laborais Planificación da acción preventiva. A posta en práctica de toda acción preventiva require, en primeiro termo, o coñecemento das condicións de cada un dos postos de traballo, para identificar e evitar os riscos e avaliar os que non poidan evitarse (art. 2.2, Real decreto 39/1997). Esta avaliación, no caso dos riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos, determinará a natureza, o grao e a duración da exposición dos traballadores. A partir da avaliación de riscos hase de planificar a actuación preventiva, asignando os recursos humanos e económicos e establecendo uns prazos para a súa execución. Con respecto aos axentes biolóxicos, a diferenza doutros contaminantes perigosos para a saúde, a avaliación debe reflectir a capacidade que estes organismos poidan ter para se reproducir e infectar. En xeral, non haberá unha relación dose-resposta do tipo que existe para outras moitas substancias e o risco pode ser elevado a concentracións pequenas. A relación será máis ben de tipo aleatorio, dose-probabilidade. IDENTIFICACIÓN DE RISCOS (fase primeira) A identificación xeral de riscos laborais é o primeiro paso do proceso de actuación hixiénica e da súa correcta execución vai depender o seu éxito. Esixe un coñecemento o máis extenso posible da organización da empresa e do proceso produtivo, das tarefas realizadas e dos seus procedementos de execución, das materias primas utilizadas e dos equipos de traballo existentes, do número de traballadores que desempeñan a súa actividade en cada posto de traballo e do seu estado de saúde, idade, sexo e tempo de exposición. Ten 118

111 ACTUACIÓN HIXIÉNICA por obxecto identificar os elementos perigosos na empresa e os traballadores afectados por estes. Non debemos esquecer que a realización dunha boa enquisa hixiénica nos axuda a centrar os problemas e a unha avaliación cualitativa do risco. Posteriormente, mediante os sistemas de toma de mostra e análise, obxectivaranse as primeiras impresións subxectivas. A identificación dos riscos pola exposición a axentes biolóxicos é inmediata cando a actividade laboral en cuestión pertence ao grupo no que existe intención deliberada de manipular axentes biolóxicos e, polo tanto, se coñece o axente ou axentes que se van utilizar no proceso. Nos demais casos, nos que sen existir intención deliberada de manipular axentes biolóxicos, dadas as características da actividade laboral, se sospeita que poida existir risco de exposición a axentes biolóxicos, a identificación destes posibles axentes irá asociada ás técnicas de toma de mostra e identificación que se analizarán con detalle máis adiante. Evidentemente, na maioría dos casos, aínda tratándose de actividades nas que os axentes biolóxicos non se manipulan de forma intencionada, non traballamos ás cegas senón que, polo tipo de actividade, os materiais cos que se traballa, os diferentes nichos ecolóxicos, etc., podemos sospeitar cales son os axentes que poden estar presentes no medio laboral. A Guía técnica para a avaliación e prevención dos riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos (INSHT, 2000), no seu apéndice 3, cuxa táboa reproducimos (táboa 6), sinala os principais indicadores que, de forma xeral, poñen de manifesto a exposición a axentes biolóxicos cando non se coñece a súa natureza, é dicir, cando non se manexan os axentes biolóxicos de forma intencionada. Establécense varias categorías de indicadores que, de forma gradual, de maior a menor especificidade, poñen de manifesto a exposición axentes biolóxicos. A primeira categoría de indicadores son os indicadores globais (IGL) que nos dan unha idea da carga microbiolóxica ambiental. A busca destes indicadores supón unha mostraxe ambiental para, mediante técnicas sinxelas e pouco custo- 119

112 ACTUACIÓN HIXIÉNICA sas, realizar unha cuantificación das bacterias e/ou fungos e fermentos presentes no medio. Os indicadores de grupo (IGR) comprenden aquelas bacterias (enterobacterias, actinomicetos) ou produtos derivados destas (endotoxinas) que poñen de manifesto a presenza dun grupo homoxéneo de axentes biolóxicos. Os indicadores específicos (IES) utilízanse no estudo daqueles lugares nos que se realizan tarefas específicas que poden favorecer a presenza destes axentes, por exemplo, a presenza de pseudomonas nos traballos con fluídos de corte. Por último, os indicadores individuais (IIN) estarían indicados no caso de que se atoparan problemas específicos relacionados con axentes biolóxicos concretos. Neste caso faise necesaria a investigación das especies individuais. ACTIVIDADE LABORAL Plantas de clasificación de residuos sólidos/compostaxe Plantas de tratamento de augas residuais Eliminación de residuos Biotecnoloxía Mantemento de sistemas de acondicionamento de aire, humificadores, torres de refrixeración POSIBLES INDICADORES IGL: Bacterias, fungos e fermentos. IGR: Gram(+), Gram (-), endotoxinas, bacterias formadoras de esporas, actinomicetos. IIN: Aspergillus fumigatus IGL: Bacterias IGR: Bacterias Gram (+), endotoxinas. IIN: Leptospira interrogans, E. coli. IGL: Bacterias, fungos. IGR: Bacterias (aerobias e anaerobias). IIN: Axentes biolóxicos específicos do proceso, por exemplo: Produtos farmacéuticos e biolóxicos: E. coli k-12, Cephalosporium spp., Streptomyces spp., Penicillium crysogenum, Bebidas alcohólicas: Saccharomyces cerevisae Alimentos: Streptococcus termophilus, Lactobacillus bulgaricus, Penicillium roqueforti, IGL: Bacterias e fungos IGR: Actinomicetos, Pseudomonas, endotoxinas IIN: Legionella pneumophila 120

113 ACTUACIÓN HIXIÉNICA Tratamento de metais IGL: Bacterias, fungos e fermentos (fluídos de corte) IGR: Enterobacteriaceas, endotoxinas IES: Pseudomonas Descontaminación IGR: Bacterias Gram (+) e Gram (-) de chans IES: Pseudomonas, Nocardia spp. Vendas por xunto, IGL: Fungos almacéns IGR: Actinomicetos Industria forestal IIN: Axentes biolóxicos que causan patoloxías específicas: - Amebiase (Entamoeba histolytica) - Lepstospirose (Leptospira interrogans) - Ornitose (Chlamydia psittaci), Produción de alimentos IGL: Bacterias, fungos e fermentos IES: Staphylococcus spp., Coliformes Manipuladores de animais IGL: Bacterias,fungos e fermentos IIN: Patóxenos causantes de enfermidades: Carbunco (bacillus anthracis) Brucelose (Brucella spp) Criptosporiodiose (Cryptosporidium spp) Rabia (virus de la rabia), Tuberculose (Mycobacterium spp) Tularemia (Francisella tularensis), Coidado da saúde IGl: Bacterias, fungos e fermentos IES: Xermes infecciosos Klebsiella spp; Mycobacterium spp; Legionella spp; TÁBOA 6. Principais indicadores para actividades nas que existe risco por exposición a axentes biolóxicos Unha vez que os riscos foron identificados, procederase á súa valoración, en función de criterios obxectivos, segundo os coñecementos técnicos existentes, ou consensuados cos traballadores, de maneira que se poida chegar a unha conclusión sobre a necesidade de evitar ou de controlar e reducir o risco (art. 5.1, Real decreto 39/1997). Tendo en conta os principios da acción preventiva evitaranse todos aqueles riscos que sexa posible e, para aqueles riscos que non puidesen evitarse, procederase entón á súa avaliación. AVALIACIÓN DOS RISCOS (fase segunda) A avaliación de riscos laborais, entendendo por tal tanto a avaliación inicial como as avaliacións de revisión, com- 121

114 ACTUACIÓN HIXIÉNICA prenderá a realización das medicións, análise ou ensaios que se consideren necesarios (art. 5.2 do Real decreto 39/1997). A avaliación efectuarase tendo en conta toda a información dispoñible e, en particular, a que se menciona no artigo 4 do Real decreto 664/1997: a) A natureza dos axentes biolóxicos aos que están ou poidan estar expostos os traballadores e o grupo a que pertencen, de acordo coa táboa e criterios de clasificación contidos no anexo II do citado real decreto. Cando un axente non conste na táboa, o empresario, logo da consulta aos representantes dos traballadores, deberá estimar o seu risco de infección tendo en conta as definicións previstas no real decreto, para os efectos de asimilalo provisionalmente a un dos catro grupos previstos neste. En caso de dúbida entre dous grupos, co fin de salvagardar a seguridade do traballador, deberá incluírse no de perigosidade superior. b) As recomendacións das autoridades sanitarias sobre a conveniencia de controlar o axente biolóxico co fin de protexer a saúde dos traballadores que estean ou poidan estar expostos aos devanditos axentes en razón do seu traballo. c) A información sobre as enfermidades susceptibles de ser contraídas polos traballadores como resultado da súa actividade profesional. d) Os efectos potenciais, tanto alérxicos como tóxicos, que poidan derivarse da actividade profesional dos traballadores. e) O coñecemento dunha enfermidade que se detectase nun traballador e que estea directamente ligada ao seu traballo. f) O risco adicional para aqueles traballadores especialmente sensibles en función das súas características persoais ou estado biolóxico coñecido, debido a circunstan- 122

115 ACTUACIÓN HIXIÉNICA cias tales como patoloxías previas, medicación, trastornos inmunitarios, embarazo ou lactación ( ver artigos 25, 26 e 27 da Lei 31/1995: protección de traballadores especialmente sensibles a determinados riscos; protección da maternidade; protección dos menores). Para a valoración dos riscos biolóxicos detectados en cada un dos postos de traballo, tense que realizar unha estimación, por unha parte, da potencial severidade do dano e, por outra, da probabilidade de que o devandito dano se materialice. De acordo co valor que se lle asigne a cada unha das dúas variables anteriores, probabilidade e severidade, establécese unha graduación dos danos. No caso dos contaminantes biolóxicos, a probabilidade de que aconteza o dano está en relación coa posibilidade de exposición e esta, pola súa vez, está condicionada pola presenza dos axentes biolóxicos no medio laboral. A devandita presenza será segura ou probable no caso daquelas actividades nas que a manipulación do axente é voluntaria e será posible naquelas outras actividades que non manipulan intencionadamente os devanditos axentes. A probabilidade de exposición reducirase coa aplicación de medidas de control. Para cada traballador, individualmente considerado, a probabilidade de exposición está estreitamente relacionada co tempo dedicado ás tarefas de risco. O número de persoas que poden estar afectadas está en relación directa co número de persoas que traballan na instalación e, entre estas, de cantas traballan en contacto directo cos axentes biolóxicos. A exposición a axentes biolóxicos pode resultar, como sinala Hernández (2003), de dúas situacións ben distintas. Nalgunhas ocasións, a exposición é o resultado dun accidente laboral no que se producen cortes, picaduras ou salpicaduras. A infección prodúcese, pois, a través dun feito puntual, sen que exista relación entre a infección e unha concentración ambiental determinada. Esta é a vía principal de transmisión para moitos axentes que se transmiten polo sangue (virus da hepatite B, VIH, etc.). Noutros casos a 123

116 ACTUACIÓN HIXIÉNICA exposición é consecuencia da presenza do axente biolóxico no medio laboral. Esta é unha situación máis propia ás estudadas pola hixiene industrial, similar á exposición a contaminantes químicos, na que a probabilidade de infección aumenta coa concentración ambiental e co tempo de exposición. A severidad del daño estará en relación co grupo en que se atopa encadrado o devandito contaminante de acordo co anexo II do Real decreto 664/1997. Ademais, hai que ter en conta outras características do axente, como son que presente toxicidade, a vía de entrada que utiliza para penetrar no organismo, a súa persistencia no medio, etc. e as características individuais dos traballadores expostos no que se refire ao seu estado inmunolóxico e de saúde e, particularmente, daqueles grupos especialmente sensibles. Tamén ha de considerarse a existencia ou non de tratamentos profilácticos e curativos. A avaliación de riscos debería incluír: a) As características dos axentes biolóxicos utilizados ou que sexa probable que aparezan no medio laboral: o seu ciclo vital, fontes de exposición, reservorios, factores que afectan a súa multiplicación, vía de transmisión, incluíndo a existencia de vectores e/ou hospedadores intermedios, capacidade de formar estruturas de supervivencia (esporas), natureza da patoxenia, virulencia, infectividade e toxicidade. b) A cantidade ou concentración de axentes que se manexa ou que se estima que pode existir no medio laboral, realizando para iso as medicións que fosen necesarias. c) Os datos epidemiolóxicos existentes. d) A dispoñibilidade de terapias axeitadas. e) Aspectos ambientais: factores que afectan a supervivencia, multiplicación e diseminación do organismo no medio; técnicas que existen para a súa detección, iden- 124

117 ACTUACIÓN HIXIÉNICA tificación e control; e medios de descontaminación existentes. Os contidos desta avaliación previa serán superiores no caso de organismos modificados xeneticamente (OMG), co fin de responder aos novos problemas que as devanditas modificacións poden supoñer. En España, a Lei 9/2003, do 25 de abril, pola que se establece o réxime xurídico da utilización confinada, liberación voluntaria e comercialización de organismos modificados xeneticamente, e o Real decreto 178/2004, do 30 de xaneiro, polo que se aproba o Regulamento xeral para o desenvolvemento e execución da Lei 9/2003, constitúen a normativa específica que se debe aplicar cando se utilicen organismos modificados xeneticamente. O artigo 7 da Lei 9/2003 estipula os requisitos para a realización de actividades de utilización confinada dos organismos modificados xeneticamente. As obrigas que establece son as seguintes: a) realizar unha avaliación previa dos posibles riscos para a saúde e o medio; b) levar un rexistro da avaliación; c) cumprir as normas específicas de seguridade e hixiene profesional e aplicar os principios e prácticas correctas de microbioloxía; d) aplicar os principios xerais e as medidas de confinamento axeitadas ao risco da actividade de utilización confinada; e) elaborar os plans de emerxencia e de vixilancia das instalacións, cando así se prevexa; e f) revisar periodicamente as medidas de confinamento e de protección aplicadas. O Real decreto 178/2004 establece unha clasificación das actividades en catro tipos en función do grao de confinamento que, a partir da avaliación previa dos riscos, resulte necesario para protexer a saúde humana e o medio. Os graos de confinamento que se consideran necesarios para as actividades de tipo 1, tipo 2, tipo 3 e tipo 4 son, respectivamente, de grao 1, de grao 2, de grao 3 e de grao 4 125

118 ACTUACIÓN HIXIÉNICA Clasificación de actividades de utilización confinada de organismos modificados xeneticamente (Artigo 12 do Real Decreto 178/2004) TIPO 1 Actividades de risco nulo ou insignificante: aquelas nas cales o grao 1 de confinamento é suficiente para protexer a saúde humana e o medio. TIPO 2 Actividades de baixo risco: aquelas nas cales o grao 2 de confinamento é suficiente para protexer a saúde humana e o medio. TIPO 3 Actividades de risco moderado: aquelas nas cales o grao 3 de confinamento é suficiente para protexer a saúde humana e o medio. TIPO 4 Actividades de alto risco: aquelas nas cales o grao 4 de confinamento é suficiente para protexer a saúde humana e o medio. O anexo I do Real decreto 178/2004 describe os principios que han de seguirse para a avaliación do risco para a saúde humana e o medio necesaria para a realización de actividades de utilización de organismos modificados xeneticamente. Máis adiante reprodúcense os elementos que se deberán ter en conta e o procedemento que se deberá seguir para realizar a avaliación do risco para a saúde humana e o medio. Elementos de avaliación do risco para a saúde humana e o medio ambiente necesarios para a realización de utilización de organismos modificados xeneticamente (Tomado do anexo I do Real Decreto 178/2004) 1. Os seguintes efectos deberán considerarse nocivos: a) Enfermidades que afecten as persoas, incluídos os efectos alérxicos ou tóxicos. b) Enfermidades que afecten os animais ou os vexetais. c) Efectos degradadores debidos á imposibilidade de tratar unha enfermidade ou de realizar unha profilaxe eficaz. d) Efectos degradadores debidos ao establecemento ou á diseminación no medio. 126

119 ACTUACIÓN HIXIÉNICA e) Efectos degradadores debidos á transferencia natural do material xenético inserido a outros organismos. 2. A avaliación deberá fundarse no seguinte: a) Identificación de calquera efecto potencialmente nocivo e, en particular, aqueles que estean relacionados con: O organismo receptor. O material xenético inserido procedente do organismo doador. O vector. O organismo doador (se se utiliza durante a operación). O organismo modificado xeneticamente resultante. b) Características de la actividade. c) Gravidade dos efectos potencialmente nocivos. Probabilidade de que se produzan os efectos potencialmente nocivos. Procedemento de avaliacion do risco para a saúde humana e o medio ambiente para a realización de actividades de utilización de organismos modificados xeneticamente (tomado do anexo I do Real Decreto 178/2004) 1. O primeiro paso no proceso de avaliación debe consistir en identificar as propiedades nocivas do organismo receptor e, se é o caso, do doador, así como calquera propiedade nociva relacionada co vector ou co material introducido, incluídas as alteracións das propiedades iniciais do receptor. 2. De xeito xeral, considéranse apropiados para a súa inclusión no tipo 1 unicamente os organismos modificados xeneticamente que presenten as seguintes características: a) Que sexa pouco probable que o receptor ou organismo de orixe cause enfermidade en seres humanos, animais ou plantas (unicamente animais e plantas pertencentes ao medio que podería verse exposto). b) Que a natureza do vector e do material incorporados sexan tales que non lle transmitan ao organismo modificado xeneticamente un fenotipo que poida causar enfermidade en seres humanos, animais ou plantas (unicamente animais e plantas pertencentes ao medio que podería verse exposto), nin efectos degradadores no medio. c) Que sexa pouco probable que o organismo modificado xeneticamente cause enfermidade en seres humanos, animais ou plantas (unicamente animais e plantas pertencentes ao medio que podería verse exposto) e que sexa pouco probable que teña efectos nocivos sobre o medio. 3. Para tomar coñecemento das informacións necesarias para a posta en práctica deste proceso, o interesado poderá ter en conta a lexislación comunitaria existente, en particular a Directiva 90/679/CEE do Consello, 127

120 ACTUACIÓN HIXIÉNICA do 26 de novembro de 1990, así como a normativa que a incorpora ao ordenamento xurídico español, en concreto o Real decreto 663/1997, do 12 de marzo, sobre a protección dos traballadores contra riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos durante o traballo. Tamén poderán tomar en consideración sistemas de clasificación nacionais ou internacionais e as súas versións actualizadas de acordo cos novos coñecementos científicos e o progreso técnico. Estes sistemas refírense a organismos naturais e, xa que logo, baséanse normalmente na capacidade dos organismos para causar enfermidades en seres humanos, animais ou plantas e na gravidade e transmisibilidade da enfermidade que poden provocar. O Real decreto 664/1997, do 12 de marzo, clasifica os organismos, en tanto que axentes biolóxicos, en catro tipos de risco en función dos seus efectos potenciais nun adulto san. Os devanditos tipos de risco poden servir de orientación para a clasificación das actividades de utilización confinada nos catro tipos de risco mencionados no apartado 1 do artigo 12. O interesado tamén pode ter en conta sistemas de clasificación relativos a elementos patóxenos vexetais e animais. Os sistemas de clasificación mencionados só proporcionan unha indicación provisional do tipo de risco da actividade e das correspondentes medidas de confinamento e control necesarias. 4. O proceso de identificación dos riscos, realizado conforme aos apartados anteriores deste anexo, debe levar á determinación do nivel de risco asociado cos organismos modificados xeneticamente. 5. A continuación, debe realizarse a selección das medidas de control e outras medidas de protección conforme ao nivel de risco asociado cos organismos modificados xeneticamente, tendo tamén en conta: a) As características do medio que poida quedar exposto aos organismos modificados xeneticamente (por exemplo, a presenza neste de fauna e flora coñecidas que poidan verse afectadas negativamente polos microorganismos empregados na actividade de utilización confinada). b) As características da actividade (natureza, magnitude, etc.). c) Calquera operación non normalizada (por exemplo, inoculación de animais con organismos modificados xeneticamente, equipo que pode xerar aerosois). A consideración dos parágrafos a) a c) para a actividade de que se trate pode incrementar, reducir ou manter constante o nivel de risco asociado cos organismos modificados xeneticamente segundo se establece no apartado A análise efectuada conforme aos apartados anteriores conducirá finalmente á asignación da actividade a un dos tipos que se describen no apartado 1 do artigo A clasificación final da utilización confinada confirmarase revisando a avaliación considerada no artigo

121 ACTUACIÓN HIXIÉNICA A avaliación debe incluír unha estimación do grao de dano potencial que pode alcanzarse, a severidade das consecuencias e a probabilidade ou frecuencia con que pode acontecer ese dano. Debe ser adecuada e suficiente. Será simple, por exemplo, cando é obvio que o risco é baixo ou que as medidas de control propostas son claramente adecuadas. Para unha operación que implique un risco baixo, ben coñecido, na que está implicado un organismo tamén ben coñecido, é posible realizar a avaliación coa información dispoñible. Non obstante, para unha operación complexa que implica varios organismos perigosos sobre os que hai algún grao de descoñecemento, a avaliación debería ser extensiva e necesitaría da adquisición de novos datos. Os perigos potenciais (efectos daniños) asociados coas actividades que implican a manipulación de OMG poden provir do receptor primario ou organismo hospedador, doutros receptores potenciais no medio, ou do organismo doador. O risco tamén pode ter a súa orixe no ADN recombinante o no material biolóxico presente no microorganismo, tanto no ADN recombinante (procedente do organismo doador ou parenteral) como no ADN que lle é propio. Outras fontes de risco son os produtos finais que se desexan obter ou outros produtos químicos ou substancias implicadas no proceso (Andrup et alii, 1990). Ademais, hai que ter presente que o ADN pode saír fóra do organismo modificado e é transmitido a outras bacterias mediante diferentes mecanismos: transformación, transdución ou conxugación. En canto ao organismo doador, aquel do que se toma a secuencia xénica que vai ser transferida, os factores que cómpre considerar ao estimar a súa potencial perigosidade son a patoxenicidade, a actividade biolóxica ou toxicidade dos produtos dos xenes externos, e a mobilidade do plásmido ou vector viral. Como norma xeral, se un organismo doador se usa soamente como unha fonte de ADN ben caracterizado que non codifica factores de patoxenicidade nin moléculas bioloxicamente activas, non é necesario considerar as características do organismo doador. Non obstante, se o inserto contén xenes que codifican moléculas bioloxicamente 129

122 ACTUACIÓN HIXIÉNICA activas, toxinas ou factores de virulencia, entón debe considerarse a información relevante do organismo doador. O organismo hospedador vai determinar en boa medida os riscos da actividade. En moitos casos, o organismo recombinante obtido pode manexarse no mesmo nivel de bioseguridade que no receptor de tipo salvaxe. Non obstante, noutros casos, pode ser necesario aplicar un maior nivel de seguridade biolóxica. Este é, por exemplo, o caso de cando se transfiren secuencias de ADN que codifican factores que poden aumentar a virulencia do receptor ou cando se crean OMG que expresan proteínas que teñen actividade farmacolóxica, tales como toxinas. Algunhas proteínas farmacoloxicamente activas só son tóxicas a niveis elevados. Neste caso, para avaliar o risco é necesario realizar unha estimación dos niveis de expresión esperados, así como dos niveis a partir dos cales a devandita proteína resulta tóxica. A OMS (2003) indica que, ao realizar a avaliación de riscos naquelas actividades nas que se manexan OMG, deben considerarse os seguintes aspectos asociados co hospedador/receptor: Susceptibilidade do hospedador Patoxenicidade da cepa hospedadora, incluíndo virulencia, infectividade, produción de toxinas e modificación do rango hospedador Grao de inmunidade do receptor e status do sistema inmunitario. Seriedade das consecuencias da exposición. Pola súa banda, tamén serán obxecto de avaliación os danos que poidan derivar directamente do xene inserido. Será necesario realizar a avaliación en situacións onde o produto do xene inserido ten propiedades bioloxicamente activas que poden chegar a producir dano, por exemplo: Toxinas Citokinas Hormonas Reguladores da expresión xénica 130

123 ACTUACIÓN HIXIÉNICA Factores de virulencia ou aumentadores Resistencia a antibióticos Alérxenos Como xa se mencionou, nestes casos débese incluír unha estimación do nivel de expresión requirido para alcanzar a actividade biolóxica. Hai que avaliar os posibles danos que se poidan producir como consecuencia da alteración de trazos patóxenos existentes na cepa hospedadora. Aínda que moitas modificacións non implican xenes cuns produtos que son inherentemente perigosos, pódense producir alteracións das características patóxenas ou non-patóxenas do organismo receptor. A modificación de xenes normais pode alterar a patoxenicidade. Para intentar identificar estes perigos potenciais, e sen ser exhaustiva, a OMS recomenda considerar os seguintes puntos: Hai un incremento na infectividade ou patoxenicidade? Podería algunha mutación invalidante do organismo receptor ser superada como consecuencia da inserción dun xene foráneo? Codifica o xene foráneo un determinante de patoxénico doutro organismo? Se o DNA foráneo inclúe un determinante de patoxenicidade, é previsible que este xene contribúa á patoxenicidade do organismo modificado xeneticamente? Existe tratamento? Poderían verse afectadas a susceptibilidade do OMG ou outras formas de terapia como consecuencia das modificacións xenéticas? É posible a erradicación do OMG? Finalmente, deben avaliarse aqueles riscos asociados co manexo de liñas celulares: presenza de secuencias xénicas potencialmente carcinoxénico e/ou presenza doutros axentes adventicios. A partir dos resultados da avaliación, e tendo como obxectivo reducir ao mínimo posible o risco, realizarase a 131

124 ACTUACIÓN HIXIÉNICA planificación da actividade preventiva na que se especificarán os medios (organizativos, materiais, persoais e económicos), a temporización das actuacións e o seguimento do seu cumprimento. 132

125 ACTUACIÓN HIXIÉNICA PLANIFICACIÓN DA ACTIVIDADE PREVENTIVA (fase terceira) O Real decreto 39/1997 establece, no seu artigo 8.1, que cando o resultado da avaliación puxese de manifesto situacións de risco, o empresario planificará a actividade preventiva que proceda co obxecto de eliminar ou controlar e reducir os devanditos riscos, de acordo cunha orde de prioridades en función da súa magnitude e número de traballadores expostos a estes. Na planificación da actividade preventiva teranse en conta os principios xerais da acción preventiva sinalados no artigo 15 da Lei de prevención de riscos laborais, que reproducimos a continuación: a) Evitar os riesgos. b) Avaliar os riscos que non se poden evitar. c) Combater os riscos na súa orixe. d) Adaptar o traballo á persoa, en particular no que respecta á concepción dos postos de traballo, así como á elección dos equipos e os métodos de traballo e de produción, con miras, en particular, a atenuar o traballo monótono e repetitivo e a reducir os efectos do mesmo na saúde. e) Ter en conta a evolución da técnica. f) Substituír o perigoso polo que entrañe pouco ou ningún perigo. g) Planificar a prevención, buscando un conxunto coherente que integre nela a técnica, as condicións de traballo, as relacións sociais e a influencia dos factores ambientais no traballo. h) Adoptar medidas que antepoñan a protección colectiva á individual. i) Dar as debidas instrucións aos traballadores. A planificación da actividade preventiva incluirá, en todo caso, os medios humanos e materiais necesarios, así como a asignación dos recursos económicos precisos para a consecución dos obxectivos propostos (art do Regulamento dos servizos de prevención). 133

126 ACTUACIÓN HIXIÉNICA As actuacións encamiñadas a eliminar ou minorar o risco pola exposición a axentes biolóxicos pódense exercer sobre tres lugares diferentes que, de maior a menor preferencia, son: o foco, o medio e a persoa. Sen afondar nas medidas de control dos contaminantes biolóxicos, que será obxecto doutro capítulo, cabe sinalar que as medidas de prevención que teñen a súa acción na orixe están destinadas a eliminar o foco do axente ou a evitar a súa saída ao medio. Son actuacións que se basean na selección de equipos de traballo, na substitución de microorganismos, na modificación do proceso produtivo ou no encerro do devandito proceso. As medidas que teñen a súa acción sobre o medio tratan de evitar a propagación e multiplicación dos axentes neste mediante a limpeza e desinfección dos lugares de traballo, a ventilación adecuada do recinto, o control de vectores (roedores, insectos, etc.) que son necesarios ou poden axudar a propagar o axente, e unha sinalización adecuada das zonas de risco, limitando a entrada do persoal. Finalmente, cabe aplicar as medidas que teñen que incidir sobre o receptor, incluíndose aquí subministrarlles información aos traballadores sobre os riscos, a formación sobre os métodos de traballo aplicables, a diminución do número de persoas expostas, o establecemento de programas de vixilancia médica e, cando non sexa posible controlar o risco mediante as actuacións anteriores, a utilización de medidas de protección individual. Igualmente han ser obxecto de integración na planificación da actividade preventiva as medidas de urxencia e a vixilancia da saúde previstas nos artigos 20 e 22 da LPRL, así como a información e a formación dos traballadores en materia preventiva e a coordinación de todos estes aspectos (art. 9.2 do Regulamento dos servizos de prevención). Por último, outros aspectos importantes dentro da planificación son a temporización das actuacións previstas e o seu seguimento. Así, o Regulamento dos servizos de prevención establece que a actividade preventiva deberá planificarse para un período determinado, establecendo as fases e prioridades do seu desenvolvemento en función da magnitude dos seus riscos e do número de traballadores expostos 134

127 ACTUACIÓN HIXIÉNICA a estes, así como o seu seguimento e control periódico. No caso de que o período en que se desenvolva a actividade preventiva sexa superior a un ano, deberá establecerse un programa anual de actividades (art. 9.3.). Na planificación da actividade preventiva contra os riscos producidos por axentes biolóxicos, a estratexia que deba seguirse será diferente segundo se trate de actividades que supoñan manipulación deliberada de axentes biolóxicos, como é o caso dos procesos industriais nos que interveñen axentes biolóxicos ou os laboratorios de diagnóstico microbiolóxico e de investigación; ou daquelas outras actividades que non impliquen a intención deliberada de manipular os devanditos axentes ou de utilizalos no traballo, pero que poidan provocar a exposición dos traballadores a estes. Este último sería o caso das actividades mencionadas no anexo I do Real decreto 664/1997. Ademais, se temos en conta o grupo de clasificación ao que pertencen os axentes biolóxicos que supoñen risco para o traballador, podemos atoparnos no medio laboral ante tres situacións diferentes que requirirán unha distinta orientación á hora de planificar a acción preventiva. Estas situacións indícanse no cadro seguinte: SITUACIÓN Risco de exposición a axentes biolóxicos do grupo 1. Risco de exposición a axentes de grupos 2, 3 ou 4, sen intención de manipulalos. Manipulación deliberada de axentes biolóxicos de grupos 2, 3 ou 4. MEDIDAS Observaranse os principios de correcta seguridade e hixiene profesional. Seguir os artigos 5 a 13 do R.D. 664/1997. Seguir os artigos 5 a 13 do R.D. 664/1997 e, ademais, as medidas de contención de acordo cos anexos IV e V do mesmo real decreto. 135

128 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISGO BIOLÓXICO

129 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS Son moitas as actividades nas que pode existir risco por exposición a axentes biolóxicos. Algunhas destas actividades pertencen a sectores nos que os axentes biolóxicos se manexan intencionadamente por seren parte indispensable do proceso produtivo. Isto sucede, por exemplo, na industria farmacéutica ou nas que empregan biotecnoloxías. Noutras actividades, non obstante, a presenza do axente biolóxico é un feito incidental, completamente alleo ao proceso produtivo. Neste caso, a exposición pode producirse cando se manexan animais, mostras biolóxicas ou materias primas que poden estar contaminadas ou sobre as que se desenvolven axentes biolóxicos. Tamén pode existir risco cando o axente biolóxico está presente no lugar de traballo por razóns completamente alleas á actividade que se está a levar a cabo, como por exemplo, un mal funcionamento dos sistemas de climatización, ventilación e aire acondicionado ou a existencia de humidades. Neste capítulo ímonos referir a aquelas actividades nas que, sen existir intención de manipular os axentes biolóxicos, se pode producir unha exposición dos traballadores aos devanditos axentes. O anexo I o Real decreto 664/1997 e, igualmente, o anexo I da Directiva 2000/54/CE establecen unha lista indicativa de actividades que poden atoparse na situación antes mencionada. Neste caso, tal como indica o artigo 4.5 do devandito real decreto, aplicaranse as disposicións dos artigos 5 a 13 deste, salvo que os resultados da avaliación o fixesen innecesario. A lista indicadora de actividades comprende as seguintes: 1.- Traballos nos centros de produción de alimentos. 2.- Traballos agrarios. 3.- Actividades nas que existen contacto con animais ou con produtos de orixe animal. 4.- Traballos de asistencia sanitaria comprendidos os desarrollados en servizos de illamento e de anatomía patolóxica. 139

130 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS 5.- Traballos en laboratorios clínicos, veterinarios, de diagnóstico e de investigación con exclusión dos laboratorios de diagnóstico microbiolóxico. 6.- Traballos en unidades de eliminación de residuos. 7.- Traballos en instalacións depuradoras de augas residuais. A continuación imos tratar de identificar os principais riscos biolóxicos específicos, e as infeccións que poden xenerar cada unha destas actividades. 1.- TRABALLOS EN CENTROS DE PRODUCIÓN DE ALIMENTOS. O termo industria alimentaria engloba toda unha serie de actividades destinadas ao tratamento, preparación, conservación e envasado de produtos alimentarios. Os riscos biolóxicos que poden presentarse na industria alimentaria dependen da natureza da materia prima que se utiliza e son de moi diversa índole, tanto pola súa orixe coma pola gravidade das enfermidades producidas. Non obstante, podemos incluílas en dous grupos. En primeiro lugar, debemos considerar as zoonoses, é dicir, aquelas enfermidades que se transmiten dos animais ao home, que son especialmente importantes naquelas industrias que utilizan produtos animais ou de orixe animal. En segundo lugar, debe terse en conta a presenza de bacterias e fungos que se desenvolven sobre os materiais e materias primas utilizados nos procesos industriais. En canto ás zoonoses, hai que destacar as seguintes: nacida (Bacillus anthracis), brucelose (Brucella spp.), leptospirose (Leptospira interrogans), tularemia (Francisella tularensis), tuberculose (Mycobacterium bovis), muermo (Pseudomonas mallei), febre Q (Coxiella burnetti) ou toxoplasmose (Toxoplasma spp.). Estas enfermidades poden contraerse polo contacto directo co animal infectado ou cos seus produtos, a través de cortes ou traumatismos da pel, contacto con augas contaminadas, inxestión ou inhalación 140

131 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS do axente ou as súas formas de resistencia ou, como no caso de Francisella tularensis, a través da picadura de insectos (tabáns e ácaros). Tamén o erisipeloide (Erysipelothrix rhusiopathiae) pode afectar os traballadores que entran en contacto con carne ou peixe en descomposición. Ademais destas zoonoses, os traballadores da industria alimentaria poden estar expostos a fungos como os pertencentes aos xéneros Aspergillus, Penicillium e a especie Candida albicans, responsables de numerosas dermatites micóticas. Así mesmo, son importantes as afeccións respiratorias, de etioloxía irritativa ou alérxica, asociadas á inhalación de esporas fúnxicas e endotoxinas. De todos os xeitos, é mellor analizar cada tipo de industria individualmente. Industrias lácteas. O leite non tratado pode ser vehículo de zoonoses tales como a brucelose e a tuberculose. A brucelose humana é producida fundamentalmente por tres especies: Brucella melitensis, que afecta fundamentalmente a cabras e ovellas e é a responsable da maioría dos casos en España; Brucella abortus, que afecta o gando bovino e Brucella suis, que ten como reservorio principal o porco, pero que tamén pode afectar o gando bovino. Parece ser que animais sans poden expulsar brucelas no seu leite durante anos. A tuberculose humana provocada polo consumo ou manipulación do leite está causada por Mycobacterium bovis. A penetración do microorganismo pode ser por vía dixestiva ou por vía respiratoria. Cando o organismo se inhala, pode producir tuberculose pulmonar que resulta indistinguible da causada por M. tuberculosis. Industrias cárnicas (mataderos) O risco principal constitúeno os posibles axentes patóxenos existentes nos animais que se vaian sacrificar. Deles derivarase a posible aparición de zoonoses como as xa mencionadas nas industrias lácteas, brucelose e tuberculose. As 141

132 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS brucelas son eliminadas, ademais de no leite, a través de produtos como o sangue, as feces, e aqueles procedentes dos partos (placenta, feto), pero tamén se atopan nos tecidos de animais infectados. Os microorganismos penetran a través de feridas cutáneas, das conxuntivas, o tubo dixestivo ou por medio dun aerosol. Tront et alii (1995), logo dun brote de brucelose nunha planta de envasado de carne de porco que afectou a 18 traballadores, realizaron un estudo que incluía a todos os traballadores da empresa e atoparon que 30 dos 156 traballadores da devandita planta padeceran brucelose en tempos recentes ao momento do estudo. Nos matadoiros e nas industrias que se dedican á manipulación e envasado de carnes poden darse casos doutras zoonoses (táboa 7). O home inféctase con Bacillus anthracis cando entra en contacto cos animais enfermos, as súas peles ou os seus excretas. A infección pode producirse a través da pel (pequenas feridas ou excoriacións), falamos entón de ántrax cutáneo, ou por inhalación das esporas, ántrax pulmonar. A tularemia ten a súa orixe no contacto directo cos tecidos de coellos infectados por Francisella tularensis ou pode ser transmitida pola picadura de tabáns ou ácaros que, estes últimos, son ademais importantes reservorios, pois poden transmitir o microorganismo por vía transovárica. A pasteurelose, causada por bacilos do xénero Pasteurella, é unha enfermidade que afecta fundamentalmente os animais, pero tamén poden afectar o home. A especie máis frecuente nas infeccións humanas é P. multocida. A febre Q, cuxo axente etiolóxico é Coxiella burnetii, adquírese por inhalación de bioaerosois procedentes dos animais infectados ou de partículas de po desecadas que conteñen o microorganismo e que poden persistir como fonte de infección durante meses. 142

133 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS TÁBOA 7. Principais zoonosis Enfermidade Animais Modos de transmisión Axente biolóxico implicados ao home responsable Brucelose Bovino, ovino, Inhalación, inxestión Brucella spp caprino e porcino e contacto (Grupo 3) Carbunco (ántrax) Bovino, ovino, Contacto, microferidas, Bacillus anthracis caprino e porcino inhalación e inxestión (Grupo 3) Dermatomicose Bovino, ovino, Contacto cutáneo Microsporum spp., caprino, porcino, Trichophyton spp. cans, gatos, (Grupo 2) Erisipeloide Porcino, ovino, Picaduras, feridas Erysipelothrix peixes, aves, o rabuñaduras rhusiopathiae (Grupo 2) Febre Q Bovino, ovino Inhalación, contacto Coxiella burnetii e caprino (Grupo 3) Leptospirose Roedores, cans, Contacto con augas Leptospira interrogans porcino, vacuno, contaminadas (Grupo 2) Ornitose Aves Inhalación Chlamydia psittaci (Psitacose) (Grupo 3) Pasteurelosis Bovino, ovino, Mordeduras, Pasteurella spp. porcino, coellos e rabuñaduras (Grupo 2) aves Rabia Animais de sangue Mordeduras, feridas Virus de la rabia quente (Grupo 3(*)) Tuberculose Bovino, ovino, Inhalación, picaduras Mycobacterium Bovis caprino, equino e ou feridas (Grupo 3) porcino Tularemia Coellos, roedores Contacto, picaduras Francisella tularensis salvaxes, ovino, de insectos (Grupo 3) porcino, De menor gravidade son a erisipeloide ou a listeriose, causadas por bacilos gram positivos. A erisipeloide é unha enfermidade producida por Erysipelothrix rhusiopathiae que é parasito de certo número de animais domésticos (porcos, ovellas, aves) e peixes, pero que tamén se atopa na materia orgánica en descomposición. A bacteria penetra na pel a través de pequenas abrasións, logo do contacto con 143

134 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS peixes, crustáceos, carne ou aves. Esta penetración vese favorecida pola existencia de cortes e traumatismos na pel das mans. Listeria monocytogenes pode ser transmitida ao home cando manipula animais infectados (aves, mamíferos, peixes e crustáceos) ou por inxestión de alimentos contaminados. Tamén pode aparecer en plantas e no chan. A toxoplasmose producida por Toxoplasma gondii é unha zoonose, neste caso producida por un protozoo. Esta é unha enfermidade especialmente grave para as mulleres embarazadas pois transmítese ao feto por vía transplacentaria. Industrias de conservas de alimentos. Dentro deste tipo de industria podemos distinguir, segundo os produtos utilizados: conservas vexetais, conservas de carne e conservas de peixe. Na fabricación de conservas vexetais o risco biolóxico derívase do contacto coas materias primas que se vaian utilizar. Os parasitos máis comúns que se van atopar son fungos e artrópodos. Os fungos poden parasitar a planta de forma natural ou poden aparecer debido ás malas condicións de almacenamento das materias primas. É posible a aparición de dermatites micóticas por Candida albicans e de afeccións respiratorias pola inhalación de esporas en suspensións aéreas. Coas conservas de carne, á parte das afeccións dérmicas producidas por contacto repetido con produtos orgánicos, existe o risco de contraer enfermidades infecciosas por manipulación de carnes infectadas: ántrax, tuberculose, brucelose e erisipeloide. Por último, a fabricación de conservas de peixe relaciónase coa infección por Erysipelothrix rhusiopathiae, presente nas materia nitroxenadas en descomposición, e cunha alteración específica dos fileteadores, producidas polo virus do limo de peixe, e que se manifesta pola aparición de espullas. 144

135 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS Industria da fariña e derivados. Na moltura da fariña o principal risco constitúeo o po que, ademais da fariña propiamente dita, pode conter esporas de fungos que creceran a expensas das materias primas almacenadas en condicións de humidade. Predominan normalmente fungo dos xéneros Aspergillus e Penicillium. Tamén hai que ter en conta a presenza do encima _-amilasa de orixe fúnxica (Aspergillus oryzae), pois pode producir asma e comprobouse que é un importante sensibilizante para os panadeiros (Elms et alii, 2003). Industria de procesado de aceites vexetais. A manipulación de aceites vexetais ocasiona, en xeral, a aparición de enfermidades cutáneas (dermatite). Tamén reaccións fronte a esporas de fungos (Aspergillus niger) cando a materia prima está balorecida. 2.- TRABALLOS AGRARIOS Os riscos biolóxicos asociados cos traballos agrícolas e gandeiros van orixinar enfermidades infecciosas, principalmente zoonose, pero tamén trastornos de tipo alérxico que afectarán fundamentalmente o sistema respiratorio. Un exemplo destas enfermidades é a alveolite alérxica, que se coñece como pulmón do granxeiro, causada pola inhalación de esporas de actinomicetos termofílicos (Micropolispora faeni, Thermoactinomyces vulgaris), que medran sobre feo mollado a temperaturas de entre 40º C e 60º C. A maior parte das enfermidades encádranse dentro das zoonoses e o traballador adquíreas a partir de animais enfermos: brucelose, nacida, tularemia, leptospirose, febre Q, rabia, tuberculose, toxoplasmose e psitacose. A psitacose é o termo que se utiliza para denominar a enfermidade que desenvolve Chlamydia psittaci no home, contraída a través das aves. 145

136 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS Algunhas enfermidades contráense directamente do chan, como é o caso do tétano (Clostridium tetani) ou as enfermidades producidas por fungos como a rinosporidiose, a blastomicose (Blastomyces dermatitidis), histoplasmose (Histoplasma capsulatum) o a coccidioidomicose (Coccidioides immitis). Os problemas respiratorios asócianse coa produción e manipulación do gran e o traballo nas unidades de confinamento de animais. Nos países desenvolvidos, nos que as explotacións gandeiras son cada vez máis grandes, increméntanse certos riscos como os derivados da produción de gases tóxicos e asfixiantes (CO, CO 2, H 3 N, H 2 S e CH 4 ), pero tamén os debidos a bioaerosois. O po das granxas é o resultado dunha combinación de alimentos, caspa e materias fecais. As partículas en suspensión no aire conteñen xeralmente unha elevada porcentaxe de proteínas e poden iniciar respostas inflamatorias e mesmo alérxicas. Moitas destas partículas teñen un tamaño o suficientemente pequeno como para alcanzar as zonas máis profundas dos pulmóns, ata onde levan substancias tóxicas (endotoxinas, glucanos, proteasas). Os granxeiros e outros traballadores que manipulan vexetais secos atópanse expostos ás esporas de Aspergillus. Estes fungos medran a temperaturas elevadas e adoitan ser abundantes na vexetación morta, húmida, quentada polos procesos de fermentación bacteriana. Medran ben nos montóns de esterco. As enfermidades infecciosas, transmitidas directa ou indirectamente polo gando, increméntanse en condicións de amoreamento (Donham, 1999). Así, os confinamentos porcinos implican un risco de transmisión aos traballadores da gripe porcina, leptospirose, salmonelose ou Streptococcus suis, por exemplo. Os confinamentos de aves de curral implican o risco de transmitir ornitose, histoplasmose, o virus da enfermidade de New Castle ou a salmonela. Os confinamentos de gando bovino poden transmitir, entre outras, a febre Q, a tiña dos animais (Trichophyton verrucosum) e a leptospirose. 146

137 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS Ocasionalmente prodúcense casos de axentes infecciosos de animais que saltan a barreira das especies e se transmiten ao home, ao que lle poden causar danos graves, mesmo a morte. Este é o caso do brote da coñecida como gripe do polo que, a finais do ano 2003 e principios do 2004, afectou o leste asiático. Non era esta a primeira ocasión na que esta enfermidade, que entre os polos ten case un 100% de mortalidade, se transmitía ao home, pero si era unha das máis graves, atendendo ao número de persoas e países afectados. Esta enfermidade faise particularmente perigosa porque os virus da gripe son moi inestables e a coincidencia espacial e temporal de virus animais moi patóxenos con virus humanos podería crear oportunidades para que estes virus intercambiasen material xenético, xerando un novo virus da gripe fronte ao cal o home dispoña de escasa ou nula protección. Existen outras enfermidades que dependen das características do traballo, da zona xeográfica ou das condicións de vida. Así, o uso de feces humanas como fertilizantes trae consigo o risco de contraer enfermidades bacterianas, como as salmoneloses (Salmonella typhi, S. paratyphi, S. typhimurium), ou parasitarias, como amebíase (Entamoeba histolytica), ascaridíase (Ascaris lumbricoides, A. suum) o anquilostomiase (Ancylostoma duodenale, Necator americanus). Cando o cultivo implica irrigación e anegamento ou cando se utiliza auga estancada para regar, pode contraerse helmintiase, pois esta práctica favorece o aumento daqueles helmintos, como é o caso dos trematodos (Schistosoma spp), que teñen caracois como hospedadores intermediarios. Hai que ter en conta que, se se utiliza rega por aspersión, se producen gran cantidade de aerosois que, no caso de que procedan de augas contaminadas, poden ser orixe de infeccións. 3.- ACTIVIDADES NAS QUE EXISTE CONTACTO CON ANIMAIS OU CON PRODUTOS DE ORIXE ANIMAL. Excluídas a gandería e a cría de animais, das que nos ocupamos no apartado anterior, neste grupo de actividades podemos considerar industrias como as dedicadas ao trata- 147

138 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS mento de la e derivados ou ao curtido e rematado de peles. Tamén os traballos en caneiras e o traballo de veterinario pertencen a este grupo. Industria da la e derivados. Unha das principais enfermidades profesionais asociadas ao procesado da la é a nacida (Bacillus anthracis), enfermidade infecciosa que, como xa se indicou, en orixe, padecen os animais e que poden transmitir secundariamente ao home. A infección do animal prodúcese a partir de esporas que se atopan no chan, auga, vexetación ou na pel dos animais (afecta principalmente herbívoros e sae ao exterior nas feces). O home pode infectarse directamente por vía cutánea, inxestión ou inhalación ou, indirectamente, pola intermediación de insectos hematófagos. Outra zoonose asociada coa industria da la é a brucelose (Brucella melitensis). Tamén a febre Q producida por Coxiella burnetii é unha enfermidade que se relaciona con esta actividade. Nas industrias do curtido e rematado de peles, os riscos biolóxicos atópanse asociados aos axentes biolóxicos que poden aparecer no pelo, en especial os xa mencionados para a industria da la: Bacillus anthracis e Brucella spp. Nos traballos veterinarios e nas caneiras son numerosos os axentes biolóxicos que poden estar presentes no medio ou que poden transmitirse ao home por contacto con animais infectados. En especial existe o risco de contraer zoonoses, particularmente aquelas asociadas a cans e gatos: virus da rabia, Echinococcus granulosus, Toxocara canis, Strongyloides stercolaris, Ancylostoma duodenale, Toxoplasma gondii, etc. 4.- TRABALLOS DE ASISTENCIA SANITARIA, COMPRENDIDOS OS DESENVOLVIDOS EN SERVIZOS DE ILLAMENTO E DE ANATOMÍA PATOLÓXICA. O traballador de hospitais está exposto a un risco biolóxico que se deriva do contacto directo ou indirecto (a través de vendaxes, instrumental, roupa, etc.) con enfermos infecciosos ou con fluídos biolóxicos procedentes destes. Como 148

139 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS consecuencia desta exposición aparecen as "infeccións hospitalarias" que poden ser de natureza vírica, entre as que destacan a hepatite B, a hepatite C e a SIDA; ou bacterianas, como a tuberculose (Mycobacterium tuberculosis), o tétano (Clostridium tetani) ou as infeccións estafilocócicas (Staphylococcus aureus) e estreptocócicas (Streptococcus spp. -S. pyogenes-proteus spp., Pseudomonas spp-p. aeruginosa-). Gestal Otero (1989), no seu libro Riscos do traballo do persoal sanitario analiza con detalle os principais riscos biolóxicos que afectan os profesionais sanitarios. É evidente que os riscos de infección non son iguais en todas as áreas de actividade sanitaria, senón que depende do tipo de traballo que se realiza en cada unha delas. En xeral, poden considerarse unha serie de actividades das que derivan riscos específicos en persoal sanitario como son (Ramos, C., 1999): A manipulación de sangue e de produtos hemoderivados, así como doutro tipo de secrecións. O manexo de mostras e tecidos que constitúen un materiais potencialmente contaminados que poden conter xermes patóxenos con capacidade infectante. O desenvolvemento da actividade en ambientes contaminados pola existencia dunha flora microbiana residente. Dentro do persoal sanitario, os grupos máis expostos son os traballadores de laboratorio, diálise, quirófanos, departamentos de enfermidades infecciosas, así como o persoal de limpeza e lavandería. 5.- TRABALLOS EN LABORATORIOS CLÍNICOS, VETERINARIOS, DE DIAGNÓSTICO E DE INVESTIGACIÓN, CON EXCLUSIÓN DOS LABORATO- RIOS DE DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓXICO. Neste tipo de laboratorios os riscos biolóxicos proceden de traballar con animais infectados, con mostras clínicas patolóxicas ou con fluídos biolóxicos (sangue, ouriños, esperma, esputos, líquido cefalorraquídeo...) infectados. O 149

140 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS sangue humano e os seus derivados son un importante foco de infección para o persoal que traballa nos laboratorios. Polo sangue transmítense enfermidades tan importantes como a hepatite B, a hepatite C ou a SIDA. Calquera mostra biolóxica que chega ao laboratorio pode ser portadora dalgún axente biolóxico, de aí que todas elas deban manexarse coma se fosen infecciosas. C. D. Miller et alii (1987), nun traballo de revisión no que recolle datos sobre 128 exposicións a axentes infecciosos que producen enfermidades que tiveron lugar no National Animal Disease Center (EE.UU.), sinalan como enfermidades máis importantes nestes centros as causadas por Brucella spp. (brucelose), Mycobacterium spp. (tuberculose) e Leptospira spp. (leptospirose). Pero tamén se observaron infeccións causadas por: Salmonella (salmonelose), virus de Newcastle (enfermidade de Newcastle), Chlamydia psittaci (Psittacose) e Thrycohyton spp. (dermatomicose). Con menor presenza, as coccidioidomicose, streptococcose e histoplasmose. Esta lista dános unha idea da gran variabilidade de axentes que poden atoparse no ambiente dos laboratorios, sobre todo cando se traballa con animais. Evidentemente, sobre todo para os laboratorios de investigación, os riscos existentes irán asociados a aqueles axentes biolóxicos cos que se está a traballar ou sobre os que se está a investigar. 150

141 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS 6.- TRABALLOS EN UNIDADES DE ELIMINACIÓN DE RESIDUOS. O persoal que traballa nas unidades de eliminación de residuos están expostos a elevados niveis de endotoxinas que se asociaron coa aparición de náuseas e diarreas nestes traballadores (Ivens et alii, 1999). Tamén a exposición a fungos se relacionou coa aparición de diarreas. Pero nas unidades de eliminación de residuos existen, ademais, riscos de exposición a numerosos axentes biolóxicos infecciosos xa que os residuos que poden aparecer son moi variables. Este tipo de riscos é especialmente importante cando se trata da eliminación de residuos sanitarios, de restos de animais ou outros nos que están presentes restos biolóxicos, de residuos procedentes de cultivos de axentes infecciosos e de materiais utilizados nos traballos anteriores. A lista de posibles axentes contaminantes é moi extensa pois, no caso dos residuos sanitarios, case calquera axente que produce enfermidade no home pode estar presente nos devanditos residuos. Martí et alii (1997) indican os principais axentes biolóxicos do grupo 3 que poden aparecer nos residuos sanitarios e destacan aqueles que causan as seguintes enfermidades: febres hemorráxicas e víricas, brucelose, difteria, meninxite, cólera, muermo, tularemia, ántrax, peste, rabia, febre Q, tuberculose, hepatite vírica, tifo, lepra, disentería bacteriana e amebiana e SIDA. 7.- TRABAJO EN INSTALACIÓNS DEPURADORAS DE AUGAS RESIDUAIS. Os traballadores empregados nestas instalacións estarán expostos á acción dos organismos produtores de enfermidades que poden transmitirse pola auga, así como á acción bacteriana derivada dos sistemas de tratamento biolóxico (lamas activados, leitos bacterianos, etc.). As augas residuais, ademais de ser un vector para a transmisión de numerosos microorganismos, son un medio de proliferación para moitos deles. Altmeyer et alii (1990) e Constans et alii (1998) indican os axentes biolóxicos máis comúns que se atopan nas augas residuais: 151

142 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS Bacterias: Bacilos entéricos (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella spp, Shigella spp, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica); Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, Actinomycetes, Leptospira interrogans, Legionella spp, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium tetani, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum., Listeria monocitogenes e Campylobacter spp. Virus: Influenzavirus; Enterovirus (Coxsackie A e B, Echovirus, Poliovirus); virus de la hepatitis A; Rotavirus; Adenovirus; Reovirus, Parvovirus (axentes de Norwalk, de Denver, de Hawaï), Coronavirus. Fungos: Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus spp, Trichophyton spp, Epidermophyton spp. Parasitos: Protozoos (Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Balantidium coli), Helmintos (Ascaris lumbricoides, Ancylostoma duodenale, Anguillula intestinalis, Toxocara canis, Toxocara catis, Trichuris trichiura, Fasciola hepática, Taenia saginata, Taenia solium, Hymenolepis nana, Toxoplasma gondii, Echinococcus spp.) Como pode apreciarse, a maioría dos axentes frecuentes nas instalacións depuradoras de augas residuais pertencen ao grupo 2 de clasificación, non obstante, algunhas bacterias como Salmonella typi, Shigella dysenteriae, M. tuberculose ou B. anthracis e algúns parasitos como T. solium o Echinococcus spp, pola gravidade das enfermidades que producen, encádranse no grupo 3 de clasificación. RISCOS BIOLÓXICOS NOUTRAS ACTIVIDADES Ademais das vistas anteriormente, que son as que aparecen mencionados no anexo I do Real decreto 664/1997, existen outras actividades nas que pode existir risco por exposición a axentes biolóxicos. Dous exemplos serían a industria forestal e de manexo da madeira (serradoiros, fabricación de mobles, etc.) e a compostaxe. 152

143 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS Coas actividades que implican o manexo da madeira relacionáronse determinados riscos como o cancro, asociado coa inhalación de determinados pos de madeira, especialmente de madeiras duras. A IARC inclúe o po da madeira no grupo 1 de carcinoxenicidade (IARC 2004). Estableceuse unha asociación clara entre a inhalación de po de madeiras duras e o adenocarcinoma das cavidades nasais e dos seos paranasais, sen descartar que poida existir relación coa aparición doutros cancros que afectan as vías respiratorias. Outros efectos negativos do po da madeira son a aparición de asma e de irritación das mucosas. Tamén as enfermidades respiratorias relacionadas co po orgánico son un risco para a saúde destes traballadores como consecuencia, entre outras, da importante exposición a fungos, especialmente nalgunhas tarefas como o desembarque e o serrado da madeira, onde se atoparon niveis de bacterias de ata 1'5 x 10 6 UFC/m3 (Duchaine et alii, 2000b). As especies predominantes varían notablemente en función da área xeográfica e do tipo de madeira coa que se traballa. Como xéneros máis frecuentes podemos citar: Penicillium, Trichoderma, Apergillus, Rhizopus e Paecilomyces. Tamén son comúns as bacterias dos xéneros Bacillus (B. subtilis, B. cereus), Corynebacterium e Clostridium. Nas actividades de compostaxe os traballadores atópanse expostos a axentes biolóxicos (fungo e bacterias) e a endotoxinas. Aínda que os axentes biolóxicos aparecen en todas as fases de tratamento da compostaxe, a maior concentración maniféstase na fase de produción do compost. Nesta fase termófila, os niveis de fungos, principalmente dos xéneros Aspergillus, Fusarium, Penicillum, Rhizopus e Cladosporium, superan as UFC/m 3, e as bacterias superan as UFC/m3 (Alonso et alii, 2001). As relativamente elevadas temperaturas que se alcanzan durante a compostaxe favorecen o crecemento dos microorganismos termofílicos e termotolerantes. Rautiala et alii (2003) atoparon que, nas granxas de porcos nas que se realiza actividades de compostaxe, os niveis de actinomicetos termófilos, principais axentes causantes do pulmón do granxeiro, superan as 105 UFC/m 3. Os niveis de fungos e bacterias son especialmente elevados nas tarefas de volteo do compost. 153

144 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS RISCOS BIOLÓXICOS NO INTERIOR DOS EDIFICIOS Malia as actividades vistas anteriormente seren as que presentan un maior risco de exposición a axentes biolóxicos, non podemos esquecer os problemas de contaminación que poden afectar a calquera traballador que desenvolve a súa actividade no interior dun edificio. Actualmente admítese que os microorganismos presentes no interior dos edificios, que se atopan no aire formando o que se coñece como bioaerosois, poden causar problemas de natureza infecciosa e alérxica. Os efectos que poden causar os distintos contaminantes biolóxicos presentes no ambiente interior dun edificio sobre a poboación exposta relaciónanse co que se coñece como síndrome do edificio enfermo e coas enfermidades relacionadas cos edificios. Síndrome do edificio enfermo A síndrome do edificio enfermo (Martí e Obiols, 1991; Berenguer, 1991) é o nome que se lle dá a un conxunto de síntomas diversos que presentan os individuos que ocupan estes edificios e que non van acompañados de ningunha lesión orgánica ou signo físico. A sintomatoloxía máis significativa inclúe: irritacións dos ollos, nariz e garganta; sensación de sequidade en membranas mucosas e pel; rouquén; respiración dificultosa; erupcións cutáneas; comechón; hipersensibilidades inespecíficas; náuseas, mareos e vertixes; dor de cabeza; fatiga mental e elevada incidencia de infeccións respiratorias e arrefriados. Sen coñecerse con exactitude as causas desta síndrome, sinálanse a ventilación pobre e a falta de limpeza como dúas das principais responsables da súa aparición. Ademais de factores químicos (CO 2, vapor de auga, CO, aldehidos, óxidos de nitróxeno, ozono, vapores orgánicos, metais, po ou fibras), físicos (iluminación, ruído, vibracións, temperatura, humidade relativa e ventilación) e psicosociais (estrés, organización do traballo, grao de satisfacción, e comunicación), tamén os contaminantes biolóxicos contribúen á aparición desta síndrome. Unha variada gama de bacterias saprófitas e fungos desenvólvense no interior dos edificios e poden crecer nas 154

145 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS superficies de recubrimento de paredes, chans e lugares onde se acumula po e nos sistemas de calefacción, ventilación e aire acondicionado. Estes microorganismos tamén poden ser introducidos no edificio dende o exterior, dende onde se amplifican e diseminan. A relación entre a síndrome do edificio enfermo e os bioaerosois céntrase, sobre todo, nas endotoxinas, micotoxinas e outros produtos microbianos porque os seus efectos, ao non depender da sensibilización inmunolóxica, serían dunha duración o suficientemente curta como para explicar que os trastornos desaparezan ao abandonar o edificio. As endotoxinas son lipopolisacáridos asociados á membrana externa das bacterias gram negativas e teñen efectos importantes sobre o sistema respiratorio, aínda a concentracións baixas. Ademais pode presentar un efecto sinérxico na resposta do organismo fronte a outros alérxenos. Os fungos, incluídos Stachybotrys chartarum (antes, S. atra) e Aspergillus versicolor, que se desenvolven nos sistemas de calefacción, ventilación e aire acondicionado, poden producir micotoxinas, responsables de ocasionar alerxias e pneumonite por hipersensibilidade. Estas micotoxinas, que son tóxicas para humanos e animais, poderían chegar a producir cancro (Autrupp, J. L. et alii, 1991). Outro axente específico que pode aparecer nos bioaerosois é o (1 3)-ß-D-glucano. Este polímero da glicosa, que aparece na estrutura da parede celular dos fungos e dalgunhas bacterias, afecta o sistema inmune e actúa sinerxicamente coas endotoxinas producindo resposta inflamatoria. Ademais, as proteínas, proteasas e outros encimas sintetizados polas bacterias e liberados ao exterior teñen tamén efectos tóxicos sobre os individuos expostos. Os contaminantes biolóxicos son responsables de producir infeccións (virus, bacterias e fungos), alerxias (bacterias, pole e fungos) e toxicidade (aflatoxinas de fungos) sobre os individuos expostos. 155

146 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS Enfermedades relacionadas con los edificios. Distinto da síndrome do edificio enfermo son as enfermidades relacionadas cos edificios (AIHA Publications, 1996). A ruta principal de exposición aos microorganismos e os seus produtos é a inhalación dos materiais aerosolizados. Indicouse xa que os bioaerosois poden causar irritacións non específicas das vías respiratorias e reducir a capacidade de resposta do sistema inmune. Non obstante, ademais destas reaccións tóxicas, poden ser responsables da aparición dunha serie de enfermidades propias deste tipo de ambientes pechados que se coñecen como enfermidades relacionadas cos edificios. Estas enfermidades poden ser de carácter infeccioso (lexionelose, febre de Pontiac) ou de hipersensibilidade, sen o crecemento invasivo do microorganismo. Entre as enfermidades infecciosas hai que distinguir entre aquelas producidas por patóxenos humanos como Mycobacterium tuberculose (tuberculose), Legionella pneumophila (lexionela e febre de Pontiac), Ortomixovirus (gripe) e Coronavirus (arrefriados) e aqueloutras producidas por organismos oportunistas, en particular certas especies de fungos que son saprófitos pero que poden producir enfermidades graves en individuos inmunoloxicamente deprimidos: Aspergillus fumigatus (asperxilose), Candida albicans (candidiase), Rhizopus spp. ou Mucor spp. (ficomicose). As enfermidades infecciosas como a tuberculose, a gripe ou outras, que se transmiten directamente de persoa a persoa a través dos aerosois, atopan nestes ambientes pechados e na proximidade entre os individuos un medio óptimo para a súa propagación. Nestes casos, a fonte de infección e amplificación da enfermidade son as persoas e a súa diseminación vese favorecida polos sistemas de aire acondicionado. O caso da Legionella é diferente pois esta bacteria, que produce dúas enfermidades diferentes (lexionelose e febre de Pontiac, a primeira é unha pneumonía aguda e en ocasións mortal, mentres que a segunda, máis benigna, se caracteriza por unha síndrome pseudogripal), desenvólvese nas torres de refrixeración dos sistemas de climatización, nos condensadores de evaporación, en bañeiras 156

147 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS Legionella con chorros de auga a presión e cabezais de ducha, lugares dende os que se disemina ao medio. Baixo a denominación de Legionella agrúpanse varias especies de bacterias gram negativas, das que a máis común é L. pneumophila, que medran na auga e que, a niveis baixos, aparecen no medio natural en lagos, ríos e correntes de auga. Aínda que pode desenvolverse a temperatura ambiente, as distintas especies de Lexionela presentan un crecemento óptimo a temperaturas relativamente elevadas, entre os 35º e os 49º C. Estas temperaturas son comúns nas torres de refrixeración, condensadores evaporatorios, sistemas de auga quente, etc., que resultan ideais para a incubación das bacterias que chegan a alcanzar concentracións moi superiores ás naturais. A inhalación da bacteria pode provocar dous tipos de enfermidades: a lexionelose e a febre de Pontiac. A lexionelose é unha pneumonía atípica causada por unha infección bacteriana aguda cun período de incubación de 2 a 10 días. Representa só o 5% dos casos de enfermidade producida por Legionella, aínda que cunha elevada porcentaxe de mortes que vai dende o 5% para a poboación en xeral sometida a tratamento axeitado, porcentaxe que ascende ao 15%- 20% cando non hai tratamento, e que pode alcanzar o 80% en individuos inmunodeprimidos non sometidos a tratamento. Baseándose nos síntomas resulta imposible distinguir entre unha pneumonía por Legionella doutras pneumonías polo que o diagnóstico require a confirmación do laboratorio. A febre de Pontiac cursa como unha síndrome pseudogripal cun período de incubación que vai das poucas horas a 3 días e só require tratamento sintomático. Tamén existen infeccións subclínicas. Os focos de contaminación a partir dos que se disemina o axente e infecta o home son os tanques de almacenamento de auga e calefacción de auga quente, torres de refrixeración, os condensadores evaporativos, os sistemas de auga quente potable, en definitiva, aqueles sistemas que manteñen a 157

148 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS auga a unha temperatura óptima para o crecemento da bacteria. Non obstante, calquera foco que teña potencialidade para xerar aerosois, incluídos billas, cabezais de duchas, chafariz de fontes, pode ser un foco potencial de contaminación se está contaminado con Legionella. A bacteria penetra mediante a inhalación de aerosois contaminados, non existindo evidencias de que se produciran infeccións pola bebida ou de persoa a persoa. O risco de contraer a enfermidade é consecuencia da fonte contaminante e do estado inmune do individuo exposto. Os individuos inmunodeprimidos son os máis afectados, non obstante, tamén os individuos aparentemente sans poden contraer a enfermidade cando a exposición é elevada. As medidas preventivas teñen que comezar polo bo deseño da instalación e por un bo mantemento e limpeza desta, de modo que se eliminen ou reduzan as zonas sucias sobre as que se desenvolven as bacterias. En segundo lugar, evitaranse as condicións que favorecen a supervivencia e multiplicación de Legionella, mediante o control da temperatura e a desinfección continua desta. Os niveis habituais de cloración das augas ou outros tratamentos da auga non garanten a eliminación da bacteria nin preveñen a súa amplificación. A desinfección dos depósitos realízase cunha concentración de 20 a 30 mg de cloro libre residual por litro, a unha temperatura non superior a 30º C e ph de 7-8. Débese facer chegar a todos os terminais da rede unha concentración de cloro libre residual de 1-2 mg/litro durante 3 ou 2 horas, respectivamente (Real decreto 865/2003). O factor principal que inflúe sobre o crecemento da bacteria é a temperatura. Por enriba dos 70º C a bacteria morre, pero por debaixo dos 27º C o único que conseguimos é atrasar o seu crecemento. Así pois, se elevamos a temperatura do depósito ata 70º C e a mantemos, polo menos, 2 horas, conseguiremos a súa desinfección. Posteriormente hase de facer chegar a auga quente a todos e cada un dos terminais (billas, duchas...), comprobando que se alcanza neles unha temperatura de 60º C. 158

149 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS O Real decreto 865/2003, do 4 de xullo, polo que se establecen os criterios hixiénico-sanitarios para a prevención e control da lexionelose, e na norma UNE , Guía para a prevención de Legionella en instalacións, proporcionan normas e criterios para previr a contaminación por Legionella a través do mantemento e a desinfección sanitaria en determinadas instalacións consideradas de risco (sistemas de distribución de auga sanitaria, quente e fría, e os equipos de arrefriamento de auga evaporativo, torres de refrixeración e condensadores evaporativo) e para o control da súa multiplicación ambiental. Dende o punto de vista da hixiene industrial deben localizarse tanto os posibles focos de Legionella como aquelas condicións que promovan a proliferación do organismo e a aerosolización da auga contaminada. Isto require observación in situ e a recollida de mostras. Cando se pretende recoller mostras para a determinación de Legionella, a mostraxe debe orientarse a este único obxectivo posto que tanto a recollida das mostras como o seu cultivo debe facerse especificamente para Legionella. Son varias as razóns para realizar unha mostraxe de Legionella, entre elas (Shelton et alii, 2000): Avaliar se nos sistemas de auga do edificio que xeran aerosois aos que se atopan expostos os ocupantes se produce unha amplificación da bacteria. Determinar se os programas de tratamento de augas que se están a levar a cabo para previr a amplificación de Legionella son eficaces. Probar a hipótese de que a Legionella pode estar a causar enfermidade nos ocupantes do edificio. Aínda que poden tomarse mostras de aire cun mostrador de impacto tipo Andersen, a mostraxe aérea de Legionella non é recomendable para determinar a exposición potencial 159

150 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS pois dá un elevado número de falsos negativos polo difícil que resulta manter o organismo vivo nas placas de cultivo. Para determinar a presenza de Legionella recoméndase tomar mostras de auga nos lugares sospeitosos. A partir destas mostras, un laboratorio experto pode determinar o número de unidades formadoras de colonias (UFC) por volume de auga e pode identificar os diferentes serotipos presentes na mostra. A toma de mostras ten particularidades especiais dependendo do lugar en que ha de tomarse (billas, torres de refrixeración, humidificadores, etc.). No Manual técnico da OSHA danse unha serie de recomendacións para a recolección, o almacenamento e o envío das mostras (OSHA, 1999). Outras enfermidades dos edificios. As enfermidades oportunistas son producidas por fungos saprófitos que se desenvolven no chan, e a súa presenza pode verse amplificada no interior dos edificios, sobre todo, cando existen superficies molladas sobre as que se poidan desenvolver. Simmons et alii (1997), nun estudo realizado sobre a colonización de fungos nos filtros dos hospitais, atoparon as seguintes especies: Acremonium spp., Alternaria alternata, Aspergillus spp., Aureobasidium pullulans, Chaetonium spp., Cladosporium spp., Epicoccum purpurescens, Monilia sitophila, Paecillomyces variotti, Penicillium spp., Rhizopus spp., Trichoderma viride. As esporas producidas por estes fungos son diseminadas polos sistemas de aire acondicionado que colonizan. Ademais destas especies, tamén son comúns en ambientes interiores Botrytis cinerea, Geotrichum candidum, Mucor spp., Phoma spp., Stachybotrys chartarum e Ulocladium spp. (Martí et alii, 1998). As enfermidades por hipersensibilidade son consecuencia das exposicións a materiais do medio que actúan como antíxenos estimulando a produción de anticorpos específicos. A maioría dos antíxenos relacionados cos edificios son de orixe fúnxica (Penicillium, Aspergillus, Alternaria), pero tamén poden estar implicadas bacterias filamentosas (Thermoactinomyces vulgaris, Micropolyspora faeni), baci- 160

151 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS los gram negativos (Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Escherichia coli) e protozoos (Naegleria gruberi, Acanthoameba). No caso dos edificios de vivendas, considéranse os ácaros do po como responsables principais destas reaccións alérxicas. Entre estas enfermidades atópanse a alveolite alérxica ou pneumonía por hipersensibilidade, a asma, a rinite alérxica ou a conxuntivite. A pneumonía por hipersensibilidade, que se describiu por primeira vez entre os granxeiros co nome de pulmón do granxeiro, aparece fundamentalmente en ambientes que conteñen gran cantidade de mofos. Trátase dunha resposta aos antíxenos das esporas destes fungos. Debe prestarse especial atención á presenza de mobiliario danado pola auga ou ás unidades de procesamento de aire contaminadas. A asma, a rinite e a conxuntivite son tamén reaccións de hipersensibilidade que se producen despois da exposición a alérxenos específicos como proteínas animais, alérxenos fúnxicos ou pole. Os principais focos de contaminación biolóxica relacionados cos sistemas de ventilación/climatización son: 1.- O aire exterior que transporta pole, bacterias e fungos, que son posteriormente introducidos dentro do edificio. 2.- Os sistemas de filtración que reteñen a materia particulada e poden ser un bo medio de proliferación para determinados microorganismos. 3.- Os sistemas de refrixeración nos que se produce a condensación do vapor de auga que contén o aire sobre os serpentíns de refrixeración, que, xunto coa sucidade, crean condicións axeitadas para o desenvolvemento biolóxico de fungos e bacterias. 4.- Os humidificadores, especialmente aqueles en que a auga é reciclada, pois poden converterse en reservorios e diseminadores de microorganismos. 5.- Os materiais porosos empregados como illantes acústicos, xa que neles se poden dar as circunstancias que favorecen o crecemento de axentes biolóxicos. 161

152 ACTIVIDADES LABORAIS QUE PODEN PRESENTAR RISCOS BIOLÓXICOS 6.- O aire interior dos edificios que foi recollendo a contaminación producida nos distintos focos, un dos máis importantes son as persoas, que poden ser portadoras de axentes biolóxicos patóxenos. 162

153 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS)

154 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) Xa mencionamos con anterioridade que o éxito da actuación hixiénica se fundamenta nunha correcta identificación dos riscos e nunha valoración o máis exacta posible destes. Cos axentes biolóxicos, ao igual que cos contaminantes químicos, pode ser necesario efectuar toma de mostras para a súa posterior análise no laboratorio. A mostraxe de axentes biolóxicos adoita ser o paso previo para a identificación de especies bacterianas ou fúnxicas ambientais (bioaerosois) que se relacionaron cunha enfermidade, permitindo establecer asociacións entre a devandita enfermidade e a exposición a organismos específicos. Tamén a determinación da concentración destes axentes ao longo do tempo e en diferentes lugares pode informarnos sobre os cambios relativos na concentración de bioaerosois e pódennos axudar a identificar áreas de elevada contaminación biolóxica. A Asociación Americana da Hixiene Industrial (AIHA, 1996) indica unha serie de casos, tanto no interior de edificios coma noutros lugares de traballo, nos que a mostraxe ambiental pode resultar interesante: Vertidos de augas residuais: poden illarse coliformes e outras bacterias gram negativas utilizando métodos de mostraxe que se usan en estudos bacteriolóxicos de augas residuais e nas plantas de tratamento. Locais húmedos: na superficie de determinados materiais que están nas zonas habitualmente húmidas dos edificios poden crecer bacterias gram negativas e numerosas especies de fungos. Augas estancadas: son numerosas as bacterias que crecen en augas estancadas, cando estas se atopan nos humidificadores poden chegar a aerosolizarse. Ambientes agrícolas: unha gran variedade de bacterias e fungos atópanse en ambientes agrícolas. Os niveis de exposición a aerosois microbianos nestes ambientes laborais son elevados, o que lles confire maiores riscos que os asociados a ambientes de oficinas. Tratamento de augas e plantas de reciclado: tamén se constatou que os niveis de bioaerosois nestas áreas son moi elevados. 165

155 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) Fluídos acuosos no traballo con metais: nas actividades industriais nas que se traballa con fluídos de corte pódese producir a aerosolización de bacterias gram negativas, incluída a Legionella. Brotes de certas enfermidades infecciosas:a mostraxe aérea de bacterias e fungos forman parte da investigación epidemiolóxica subseguinte ao brote da enfermidade infecciosa. Diagnósticos médicos que suxiren endotoxinas ou micotoxinas como axentes etiolóxicos: a mostraxe de aerosois ten grande importancia na identificación dos axentes que poden causar enfermidades como a hipersensibilidade pulmonar. Aplicación a investigacións específicas para determinar danos que se considera que son o resultado da exposición a axentes biolóxicos. En xeral, podemos dicir que a mostraxe dos bioaerosois no ambiente laboral é unha das principais ferramentas de que dispón o hixienista industrial para asegurar a calidade do aire interior, evitar brotes de enfermidades infecciosas e, en definitiva, protexer a saúde dos traballadores que desempeñan actividades nas que poden presentarse riscos biolóxicos. Outras situacións para as cales é apropiado a mostraxe dos bioaerosois son as investigacións epidemiolóxicas e a realización de estudos de investigación. Habería que destacar, ademais, que a mostraxe de axentes biolóxicos é útil á hora de comprobar a efectividade das medidas de contención e protección adoptadas. A NECESIDADE DA MEDICIÓN Evidentemente, a primeira razón para mostrar axentes biolóxicos é darlle cumprimento a algunha esixencia normativa. Pero, ademais desta, existen outras razóns que poden xustificar a medición de micoorganismos e endotoxinas no aire no lugar de traballo, como son: avaliar a exposición dos traballadores 166

156 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) avaliar as características biolóxicas do aire en diferentes puntos e/ou en diferentes momentos e en diferentes intervalos de tempo. A toma de mostras pode interesar cando se pretende localizar unha fonte de emisión de microorganismos, medir a exposición dun traballador, diaria ou nunha quenda de traballo, identificar un pico de exposición, verificar a eficacia das medidas de control ou controlar unha actividade emprendida para reducir a exposición. É importante verificar que a mostraxe e a análise se corresponden co obxecto da avaliación e coa detección do compoñente buscado do bioaerosol. Sería conveniente poder medir os bioaerosois viables e non viables. A mostraxe tamén pode servir de apoio para o diagnóstico médico xa que permite establecer a etioloxía microbiolóxica dunha enfermidade. Pola súa banda, un diagnóstico médico (por exemplo, asperxilose, Aspergillus fumigatus) pode orientarnos sobre a presenza de determinados axentes biolóxicos no ambiente, reducindo significativamente o número de mostras que é necesario tomar. Non obstante, na aparición dalgunhas enfermidades (inflamación da vías respiratorias e pneumonite de hipersensibilidade) poden estar implicados moitos axentes microbiolóxicos patóxenos e o número de mostras debe ser moito maior. É esencial establecer o obxectivo da medida e o xeito en que se interpretarán os resultados. En primeiro lugar, hai que determinar se a medición está xustificada e, se o está, hai que definir que é o que imos medir, valorando se a información que poidamos obter vai contribuír a solucionar o problema que se nos presentou. Logo, antes de proceder á mostraxe, han de establecerse os criterios que se van seguir para interpretar os resultados. Unha vez que se decidiu realizar a mostraxe e os axentes que nos interesan, débese establecer un plan de mostraxe na que se fixen os lugares e tempos de mostraxe, o número de mostras e a súa distribución espacial e temporal e o método da toma de mostra e da análise, é dicir, onde, cando, durante canto tempo e como mostrar. Hernández (2003) establece uns criterios de 167

157 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) medición para dar resposta a cada unha das preguntas formuladas: por que medir?, que se vai medir?, onde e cando debe medir? e cantas mostras hai que tomar? A realización de medicións representativas da exposición laboral aos contaminantes microbianos é unha tarefa difícil que, non obstante, é necesaria para obter unha información fiable que nos permita avaliar e minimizar a exposición a axentes biolóxicos. A incerteza da medida provén do método de mostraxe e do método de análise. O equipo de mostraxe introduce as súas propias limitacións. Os dous métodos deben ser validados. Non obstante, a validación dos métodos de medida de microorganismos está limitada pola falta de materiais de referencia e/ou métodos de referencia. Tamén a reproducibilidade do método debe estar definida. A variabilidade dos niveis de exposición aos microorganismos pode ser moi elevada, mesmo moito maior que a precisión dos métodos de medida. A incerteza na estimación da exposición a partir dunha soa medida é moi grande, aínda que esta proceda dun período de mostraxe grande. Os períodos de mostraxe curtos aumentan a incerteza. A identificación das causas de variabilidade poden axudar a reducir a dificultade da medición pois permite establecer estratexias de mostraxe para tarefas ou situacións de exposicións concretas. A norma UNE-EN dá unhas recomendacións para a selección dos métodos de medida así como fórmulas para o reconto de colonias. Esta norma europea non se aplica aos virus nin aos microorganismos patóxenos específicos nin a toxinas distintas das endotoxinas, aínda que algúns principios de medida poden ser os mesmos. Como xa vimos, os axentes biolóxicos poden desenvolverse sobre diferentes tipos de substratos: chan, auga, materias primas utilizadas na industria, animais ou vexetais, etc. O único medio que podemos dicir que non é apto para o crecemento e a multiplicación dos axentes biolóxicos é o aire. Isto non quere dicir, non obstante, que no aire non existan este tipo de axentes. Moi ao contrario, a súa presenza é 168

158 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) abundante por medio do que se coñecen como bioaerosois e, de feito, o aire, constitúe unha das principais vías de transmisión destes. A través do aire lévase a cabo a propagación e diseminación de numerosos microorganismos, entre os que se atopan gran cantidade de virus, bacterias e a maioría dos fungos, así como os produtos que derivan deles (endotoxinas, micotoxinas, proteínas...). Como veremos máis adiante, existen variados sistemas para a toma de mostras destes contaminantes. En xeral, as concentracións de axentes biolóxicos en ambientes interiores son menores que as concentracións na zona exterior. No caso de que no interior se atopen un ou máis xéneros de microorganismos nunha concentración superior á exterior, debe concluírse que existe un foco de contaminación ou unha fonte de amplificación que deberá investigarse. Cando se considera que é necesario unha mostraxe, é aconsellable facelo antes, durante e despois de que a área de traballo estea ocupada, incluíndo as veces en que se acendan e apaguen a calefacción, ventilación e sistema de aire acondicionado. A TOMA DE MOSTRA Antes de comezar a expoñer como se realiza a mostraxe e a caracterización dos bioaerosois, é útil aclarar unha serie de conceptos que nos permitirán comprender mellor todo o proceso. En primeiro lugar, é necesario distinguir entre os microorganismos viables e os non viables. Os microorganismos viables son aqueles metabolicamente activos, é dicir, que están vivos e teñen capacidade para se reproduciren. No caso das especies patóxenas para o home, son potencialmente infectivos. Estes microorganismos, polo menos teoricamente, poderían cultivarse en medios artificiais sempre que utilizásemos un sistema de toma de mostra e unha técnica de cultivo axeitados aos seus requirimentos. Non obstante, non todos os microorganismos viables poden ser cultivados en medios artificiais. Por esta razón imos diferenciar dentro dos microorganismos viables entre cultivables e non cultivables. 169

159 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) Os microorganismos viables cultivables son aqueles para os que dispoñemos dunha tecnoloxía e uns procedementos que nos permiten conseguir que se multipliquen sobre os medios de cultivo. O tipo de microorganismo de que se trate, en función dos seus requirimentos, vai determinar tanto a técnica de mostraxe como o posterior manexo e cultivo das mostras. Os microorganismos cultivables recoñécense macroscopicamente pola formación de colonias sobre as placas de cultivo. Cada colonia de crecemento correspóndese normalmente cun microorganismo, aínda que en ocasións pode ter a súa orixe nunha agrupación de células. Non obstante, a cuantificación dos microorganismos polo método de reconto de colonias sobre a placa supón, normalmente, unha infraestimación da concentración ambiental real. Os resultados vense afectados pola eficiencia do mostrador, a viabilidade do microorganismo, a elección do medio de cultivo, as condicións de crecemento, especialmente a temperatura de incubación, e as interaccións entre os diferentes organismos. Chang, C-W. et alii (1995) analizaron diferentes factores que poden afectar o reconto das colonias: densidade de esporas na superficie de captación, concentración de nutrientes no medio de cultivo, tempo de incubación da mostra e capacidade do sistema de observación para distinguir colonias solapadas. Estes autores comprobaron que o número de colonias enmascaradas, é dicir, aquelas que proceden da fusión de varias colonias iniciais, aumenta co incremento da densidade superficial de esporas e co incremento do tempo de incubación; mentres que a diminución da concentración de nutrientes reduce o diámetro das colonias e, polo tanto, o enmascaramento, aínda que tamén limita a xerminación e crecemento das esporas. A capacidade dun sistema de observación para recoñecer colonias solapadas depende do tamaño da colonia, do nivel de amplificación (aumento) utilizado e da pigmentación e morfoloxía da colonias. As colonias que son morfoloxicamente diferentes van ser máis doadas de distinguir e o enmascaramento será, xa que logo, menor. Morring et alii (1983) e Smid et alii (1989) estableceron a influencia que 170

160 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) teñen o sistema de toma de mostra e o medio de cultivo sobre a cuantificación dos fungos viables. Os microorganismos viables non cultivables, son aqueles que, aínda estando vivos, non somos capaces de conseguir que se multipliquen no laboratorio. Esta incapacidade pode deberse a que o microorganismo, a consecuencia do estrés a que se ve sometido durante a mostraxe, sofre danos celulares irreparables ou a que os seus requirimentos nutricionais e/ou ambientais son moi específicos e non existe un método axeitado para o seu cultivo. Estes microorganismos poden ser infectivos para o home. Os microorganismos non viables son aqueles que non están vivos e, xa que logo, tampouco poden ser cultivados. Ao non seren capaces de se reproduciren, non poden ocasionar unha enfermidade infecciosa, malia poder ser responsables de producir enfermidades de tipo tóxico ou alérxico. Tanto os microorganismos viables non cultivables como os non viables poden ser mostrados con técnicas semellantes ás utilizadas para os microorganismos cultivables, non obstante, as técnicas de cuantificación no laboratorio van ser necesariamente diferentes ás baseadas no reconto de colonias. Evidentemente, non todos os sistemas de cuantificación ofrecen resultados semellantes. A cuantificación destes microorganismos realízase fundamentalmente por técnicas microscópicas. Eduard et alii (1990) compararon as técnicas baseadas no cultivo e diversas técnicas de microscopía (óptica, de epifluorescencia e electrónica de varrido) para a cuantificación de microorganismos mostrados sobre filtros de membrana. Estes autores concluíron que, malia as técnicas de microscopía electrónica de varrido e de microscopía de epifluorescencia dar resultados similares, as técnicas de cultivo e microscopía óptica ofrecen estimacións inferiores aos dos outros dous sistemas. As técnicas baseadas no cultivo unicamente permiten cuantificar os organismos viables e cultivables. Ademais, tampouco permiten diferenciar os organismos individuais dos agregados, o que dá como resultado unha infraestimación dos niveis de microorganismos existentes (Karlsson e Malmberg, 1989). 171

161 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) As diferentes técnicas de mostraxe, cuantificación e identificación dos axentes biolóxicos no aire serán analizadas con detalle máis adiante, non obstante, imos resumir aquí o procedemento básico. Para mostrar bacterias e fungos cultivables, os bioaerosois pódense recoller empregando algún dos seguintes sistemas: impactación sobre un medio sólido de amplo espectro (ágar), filtración a través dun filtro de membrana, ou burbullo (impingement) nun medio líquido isotónico. O método de toma de mostra utilizado vai delimitar, en parte, os métodos de análise que se poden utilizar. Os organismos recollidos por impactación sobre unha superficie de ágar deben incubarse durante un tempo que permita un crecemento suficiente para que poidan ser cuantificados. Logo, para levar a cabo a súa identificación posterior, pode ser necesario sementar as distintas colonias sobre un medio selectivo ou diferencial, e incubalas de novo a diferentes temperaturas. Cando ando a captación se realiza sobre medio acuoso, unha alícuota deste medio seméntase en ágar directamente, ou logo de realizar unha ou varias dilucións. Tamén se pode filtrar todo o volume a través dun filtro de membrana que despois será tratado como as mostras captadas por filtración. Se a mostra se tomou sobre filtros de membrana, estes poden sementarse sobre unha superficie de ágar para, posteriormente, resementar cada unha das colonias. Os filtros tamén poden lavarse nunha solución salina isotónica e sementar logo unha alícuota desta solución, de modo similar a como se fai cos burbulladores. O método de filtración resulta moi práctico á hora de mostrar bioaerosois non cultivables e non viables, pois os filtros poden analizarse por métodos que non se basean no cultivo. Os microorganismos captados polos procedementos anteriores son analizados mediante técnicas que permiten a súa cuantificación e identificación. En función do tipo de microorganismo ou das pretensións da análise pode recorrerse a técnicas de microbioloxía clásica, microscópicas, 172

162 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) bioquímicas, inmunolóxicas ou xenéticas. Malia a cuantificación dos microorganismos, polo menos dos cultivables, ser relativamente sinxela, aínda que require moito tempo, a identificación das especies pode ser moi laboriosa. O emprego de técnicas de microbioloxía clásica esixe a realización de sementeiras sucesivas dos microorganismos cultivables, para illar cada unha das especies, así como a realización de numerosas probas que permitan establecer as súas características. Os métodos baseados no cultivo de microorganismos, como sinala Eduard (2003), son pouco axeitados para estimar a exposición a axentes non infecciosos, pero que producen afeccións como bronquite, asma ou febre por inhalación, posto que unha gran parte destes non son cultivables e, non obstante, producen efectos. As técnicas de microbioloxía clásica inclúen a observación das características de crecemento; da morfoloxía celular ou das esporas; tinguidura simple e diferencial; e probas bioquímicas, fisiolóxicas e nutricionais para bacterias. En ocasións os microorganismos poden cuantificarse mediante microscopía (óptica, de fluorescencia ou electrónica), non obstante, non é posible a identificación das especies mediante o emprego exclusivo destas técnicas. Para identificar os microorganismos, tanto viables como non viables, existen unha serie de técnicas de gran sensibilidade e especificidade, como son a reacción en cadea da polimerasa (PCR) e o ensaio inmunoadsorbente ligado a encima (ELISA). Estes últimos métodos son xeralmente cualitativos, e as investigacións actuais dirixen os seus esforzos á súa modificación para obter resultados semicuantitativos ou cuantitativos. Eduard e Heederik (1998) realizaron unha revisión dos diferentes métodos de mostraxe e das distintas técnicas de análise das mostras obtidas, tanto para microorganismos cultivables como non cultivables, incluíndo aquelas técnicas utilizadas para a análise dos constituíntes dos bioaerosois microbianos e os seus produtos (endotoxinas, glucanos, antíxenos e alérxenos). Estes autores conclúen que, aínda que sería de esperar que os métodos non baseados no cultivo ofrecesen unha mellor estimación da exposición que 173

163 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) os métodos baseados no cultivo, a súa capacidade, validez e idoneidade dependen da capacidade para diferenciar entre especies naqueles casos en que os danos producidos se corresponden con respostas específicas a un axente biolóxico (asma alérxica, rinites alérxicas ou pneumonite por hipersensibilidade), xa que nestes casos as especies de microorganismos presentes son o máis importante. En tales estudos serían preferibles métodos como os inmunoensaios. Para respostas non específicas (inflamación das vías respiratorias, asma non alérxica, bronquite e febre por inhalación), a identificación de especies é menos importante. Como se pode ver, a mostraxe de contaminantes biolóxicos en ambientes laborais non é tan directa como a mostraxe de contaminantes químicos. A aplicación da maior parte das técnicas descritas son máis lentas e a maioría dos métodos requiren un coidado moito maior no manexo dos equipos de mostraxe e na conservación das mostras. E, por suposto, a interpretación dos resultados obtidos depende en boa medida da estratexia de mostraxe, que implica a elección do sistema de mostraxe e a técnica analítica. A ESTRATEXIA DE MOSTRAXE Cando nos propoñemos investigar unha situación determinada xorde a cuestión de que método se debe empregar. A resposta a esta pregunta non é sinxela, pois non existe un único método que sexa útil en todas as situacións. O coñecemento do proceso produtivo ten que nos permitir identificar as actividades, os momentos e os lugares que entrañan risco de exposición, así como o tipo de axentes biolóxicos máis probables e as súas características. A existencia dunha idea previa sobre a concentración ambiental dos devanditos axentes vainos servir para planificar a estratexia de mostraxe. Esta debe concretar algúns aspectos básicos como: o tipo de mostrador e medio de cultivo que imos utilizar, o tempo de mostraxe e a velocidade de fluxo do aire durante este, o número de mostras que se van tomar e a súa localización espacial (incluíndo mostras exteriores se fosen necesarias), os momentos en que se debe realizar a toma de mostras (pode ser mesmo necesario mostrar en días 174

164 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) diferentes), o tratamento estatístico dos datos, etc. Outras características como o tipo de mostrador, o medio de cultivo e o tempo de mostraxe estableceranse en función dos microorganismos que se sospeita que están presentes e da súa concentración ambiental. Para que a mostra ambiental represente a situación real, a estratexia de mostraxe ha de satisfacer varias esixencias: A estratexia de mostraxe debe maximizar a probabilidade dun verdadeiro positivo, é dicir, encontrar a contaminación biolóxica cando está presente, así como minimizar a posibilidade do falso negativo (non encontrar contaminación biolóxica cando existe). Ao mesmo tempo, a estratexia debe de planificarse de modo que o número de mostras que sexa necesario tomar non sexa excesivo. A investigación dunha situación de risco biolóxico debe subministrar resultados nun tempo razoable (e non meses despois). Isto implica que non podemos pretender obter unha información tan exhaustiva que prolongue a investigación no tempo máis alá do razoable, pois as vantaxes que poderiamos obter con ese maior coñecemento serán normalmente inferiores aos prexuízos causados polo atraso na toma de medidas. A investigación biolóxica non debe ser a única información sobre o risco de exposición. Non obstante, antes de recorrer á mostraxe de axentes biolóxicos, debemos pararnos a pensar se aquel é realmente necesario e útil. Así, por exemplo, no caso das enfermidades relacionadas co local de traballo, aínda que os microbios forman parte do problema en moitos casos, non son a única causa. Nestes casos, é conveniente, en primeiro lugar, realizar unha detida inspección visual do edificio en busca daquelas situacións que poden causar problemas, como a situación inadecuada das entradas de aire, a posibilidade de entrada de gases ao sistema de aire acondicionado ou a presenza de altos niveis de compoñentes orgánicos volátiles producidos polo mobiliario de oficina (alfombras novas, pintado recente, falta de limpeza no edificio, etc.). 175

165 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) Posteriormente, deberase revisar o sistema central de aire acondicionado, incluíndo filtros, cazoletas de drenaxe, humidificadores, deshumidificadores e torres de refrixeración. Tamén se deben comprobar as unidades periféricas e o local de traballo, con respecto a conducións de auga, fugas, condensacións e humidades. Unha vez que comprobamos que non existe ningún dos problemas anteriores, se os traballadores se seguen queixando, é cando procede realizar un programa de mostraxe para contaminantes biolóxicos. O programa de mostraxe pode poñer en evidencia problemas microbiolóxicos que non son apreciables a simple vista e permite coñecer a natureza e o alcance da contaminación. Os datos obtidos poden utilizarse logo para determinar o nivel de protección necesario. Ao planificar a estratexia de mostraxe deben terse en conta algunhas consideracións: A investigación da contaminación causada por fungos debe comprender unha mostraxe ambiental e unha mostraxe da superficie sobre a que se sospeite que hai crecemento, para facilitar a localización do foco de infección e definir a diversidade dos reservorios biolóxicos. As mostras ambientais poden recollerse baixo condicións de operación normais (mostraxe inactiva), tras axitar o po dos reservorios, simulando a actividade dos ocupantes (mostraxe semiagresiva) ou perturbando vigorosamente os reservorios para establecer unha fonte de biocontaminante (mostraxe agresiva). Unha vez que se decidiu realizar a mostraxe, é o momento de seleccionar un método axeitado e, o que é máis importante, definir o obxectivo específico da mostraxe. Deben establecerse os puntos de mostraxe, o número de mostras que hai que tomar e o axeitado número dos de control. Tamén deben considerarse as condicións en que se vai realizar a mostraxe. No que respecta ao número e localización dos puntos de mostraxe, cando nun local de traballo se sospeita que existe 176

166 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) contaminación biolóxica, deben seleccionarse aquelas áreas nas que se supón que se pode dar unha maior contaminación, pois son os puntos de maior exposición. É moi importante establecer suficientes puntos de mostraxe para asegurar que a información obtida reflicta a realidade. Para establecer as devanditas áreas pode realizarse unha mostraxe preliminar de aire e de superficies. O número de mostras necesario vai depender do tamaño do local e do tipo de traballo que se vai investigar. Se se sospeita que existe unha gran variabilidade temporal, pode ser máis interesante tomar un maior número de mostras durante períodos máis curtos que tomar menos mostras durante máis tempo. O procedemento estatístico que utilicemos para analizar os resultados vainos indicar o número mínimo de mostras que debemos tomar, non obstante, para o caso dos axentes biolóxicos, atendendo á súa elevada variabilidade, recoméndase tomar un número de mostras o máis extenso posible, tendo en conta consideracións prácticas e económicas. Como control, deben incluírse áreas non contaminadas. Con este fin utilízanse, xeralmente, mostras tomadas no exterior do local, preferiblemente próximas aos puntos de entrada de aire. Cando sexa necesario comparar concentracións de fungos e bacterias ambientais, é recomendable tomar máis dunha mostra en cada un dos puntos elixidos, ou para cada unha das condicións ambientais que van ser comparadas. Para o estudo da variación da contaminación co tempo, deben separarse suficientemente as tomas de mostra (p. e., mañá e tarde). Tamén pode ser necesario realizar a mostraxe en diferentes días, meses ou estacións, pero, neste caso, as necesidades de tempo e económicas poden limitar o número de mostras. Unha recomendación que cómpre ter en conta é que é conveniente seleccionar o laboratorio de análise antes de proceder á mostraxe. O laboratorio poderá orientar- 177

167 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) nos sobre algúns aspectos da toma de mostra, como o tipo de equipo máis apropiado e os medios de captación que se deben empregar, así como sobre o modo de conservar a mostra ata o momento do seu envío e de como debe realizarse este. Tamén debe de planificarse como se van enviar as mostras ao laboratorio. Poden enviarse por correo aínda que, neste caso, existe o risco de que, pola axitación, sobre todo nas mostras tomadas sobre filtros, se desprendan parte dos bioaerosois. A forma de envío das mostras biolóxicas debe de axustarse, en todo caso, ás instrucións legais existentes. As operacións da mostraxe deben documentarse co fin de obter uns valores de microorganismos e endotoxinas que sexan comparables e seguros. Na norma UNE-EN indícase que a documentación da mostraxe debe incluír, como mínimo, os seguintes parámetros: nome da organización e da persoa que fai a análise; q data da mostraxe; código de identificación único para a mostra; nome e enderezo da empresa onde se obtivo a mostra, ou un identificador único para garantir a confidencialidade; localización da mostraxe; tipo e nome do mostrador e tipo e nome do substrato de captación empregado, incluíndo o volume do medio de captación utilizado para os mostradores líquidos; tipo de mostraxe (individual ou estática); localización do equipo de mostraxe; localización da entrada da mostra e a orientación relativa ao movemento do aire; o comezo e o final da mostraxe e a súa duración; caudal (L/min.); volume mostrado; fracción mostrada (ver a Norma EN 481) almacenamento da mostra e transporte; condicións ambientais (temperatura, humidade, condicións climáticas exteriores); propósito da mostraxe; 178

168 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) outras observacións (condicións de almacenamento, data e hora de envío, data e hora de chegada, temperatura, etc.). MÉTODOS DE TOMA DE MOSTRA DE FUNGOS E BACTERIAS Principios da recolección de bioaerosois O método máis rudimentario para a recolección de bioaerosois é a sedimentación. Consiste na exposición ambiental das placas Petri, que conteñen o medio de cultivo axeitado durante un tempo determinado. Este tipo de mostraxe achega datos cualitativos e pode utilizarse para facer estudos comparativos. Non obstante, os resultados obtidos non poden referirse a un volume de aire, polo que non nos dá unha concentración ambiental. Este é un dos seus principais inconvenientes. Para obter valores de concentración ambiental referidos a un volume de aire temos que recorrer a unha serie de aparatos que, de modo activo, captan o volume desexado. A maioría dos aparatos que se utilizan para a mostraxe de bioaerosois basean o seu funcionamento en técnicas que separan as partículas da corrente de aire e as recollen nun medio preseleccionado. As tres técnicas máis comúns usadas para separar e recolectar os bioaerosois son a impactación, a filtración e a recollida sobre un medio líquido por burbullo (impingement). Estes mostradores constan dun sistema de aspiración que se utiliza para captar un volume determinado de aire, e un mecanismo de separación e recolección dos axentes biolóxicos contidos no aire aspirado. Os sistemas de aspiración son similares aos utilizados para a toma de mostras de contaminantes químicos, co emprego de bombas de aspiración que van, nalgúns casos, integradas dentro do propio mostrador (impactadores) e, noutros, son independentes e ensámblanse ao sistema mediante as conducións axeitadas (burbulladores, filtros, mostradores persoais). Unha particularidade dos mostradores de bioaerosois é que deben estar deseñados de modo que aproximen a súa 179

169 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) eficiencia na captación de partículas á eficiencia do sistema respiratorio humano, de conformidade cos criterios internacionais establecidos pola Organización Internacional para a Estandarización (ISO) e o Comité Europeo de Normalización (CEN). Para mostrar partículas de pequeno tamaño (esporas de fungos, células bacterianas), tanto o sistema de mostraxe como o sistema respiratorio presentan unha grande eficacia, pero a desviación é moito maior no caso de que os axentes biolóxicos estean presentes en partículas de maior tamaño (> 10 µm), por exemplo, cando aparecen formando agregados. Kenny et alii (1998) indican unha serie de características que deben de cumprir os mostradores persoais, que poden ser parcialmente aplicables a calquera tipo de mostrador de bioaerosois, entre as que se atopan: Poder usarse durante a duración das tarefas que van ser estudadas, que pode ir de poucos minutos á xornada completa. Separar as fraccións inhalable e respirable. Ser doado de esterilizar, ensamblar, transportar, desensamblar e limpar. Permitir retirar e cuantificar o material recollido con poucos pasos de preparación. Os substratos de recolección deben proporcionar boas porcentaxes de recuperación para o reconto total de células, o cultivo de células viables ou a extracción de ADN. A eficiencia da mostraxe pode verse afectada por outros aspectos alleos ao mostrador como son o estrés durante o transporte das mostras ou o tempo transcorrido entre a mostraxe e a análise. Impactación A impactación é unha técnica que separa as partículas dunha corrente gasosa baseándose na inercia da partícula. Un impactador consta dunha serie de tobeiras (circulares ou en forma de rañura) e dunha superficie de captación. O sistema de aspiración capta un volume determinado de aire 180

170 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) que, en función do fluxo e do diámetro (ou superficie) do orificio de entrada, penetrará no mostrador a unha determinada velocidade. As partículas, pola súa propia inercia, e en función da súa masa, saen da corrente de aire e impactan sobre o medio de captación (figura 9). A superficie de captación pode estar formada por unha placa engraxada, un filtro, ou un medio de cultivo (ágar) en placas de Petri sobre os que quedan retidas os bioaerosois. Un dos parámetros que define un impactador é a eficiencia para captar as partículas, pero esta é función do tamaño da partícula, da velocidade que leva o aire no interior do mostrador e tamén do medio de captación utilizado (Macher e Hansson, 1987 e Rubow et alii, 1987). Por iso, ao estudar a eficiencia dos impactadores se establecen curvas que relacionan o tamaño da partícula e a eficiencia de captura nas condicións de manexo. A partir destas curvas, que teñen forma sigmoidal, establécese o diámetro de corte efectivo (d 50 ) para o que a eficiencia de captación é do 50%. A eficiencia de captación do mostrador será superior ao 50% para aquelas partículas cun diámetro aerodinámico maior ao d 50, aproximándose rapidamente ao 100% para partículas non moito maiores que o devandito diámetro. Para aquelas partículas que teñan un diámetro aerodinámico menor que o d 50, a eficiencia de captación é inferior ao 50%. O diámetro aerodinámico (d ae ) defínese como o diámetro dunha esfera hipotética de densidade a unidade (1 g/cm 3 ) que ten a mesma velocidade de sedimentación que a partícula. As partículas cun diámetro aerodinámico maior que o d50 impactarán con facilidade sobre a superficie de recolección, mentres que as partículas máis pequenas tenderán a pasar a través do mostrador. Os impactadores selecciónanse de modo que recollan as partículas de tamaño desexado. Os impactadores de fervenza, dos que o máis coñecido é o de Andersen de seis niveis (Andersen, 1958) (figura 9), permiten a clasificación dos microorganismos en función do seu tamaño. O coñecemento da distribución dos aerosois por tamaños ten unha importancia esencial xa que a deposición das partículas nas diferentes rexións do tracto respiratorio (alvéolos, árbore tráqueo-bronquial ou nasofarinxe) 181

171 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) dependen do tamaño da partícula, máis concretamente do seu diámetro aerodinámico. Os impactadores de fervenza presentan na súa estrutura unha morea de plataformas (niveis), cada unha delas coas súas propias tobeiras e o seu substrato. O diámetro dos orificios decrece ao pasar dun nivel a outro, aumentando a velocidade do aire en cada nivel, coa conseguinte diminución do d 50. Como resultado deste deseño, cada plataforma recolle partículas máis pequenas que a plataforma anterior. As partículas quedarán retidas nun ou noutro nivel en función do seu diámetro aerodinámico. Na plataforma final utilízase un filtro, de modo que se recollen todas as partículas non impactadas nos niveis anteriores. Actualmente existen impactadores de varios niveis, resultado das modificacións realizadas sobre a estrutura dos impactadores de fervenza tradicionais, que están adaptados á toma de mostras persoais (Macher e First, 1984; Rubow et alii, 1987). Non obstante, estes instrumentos non son tan utilizados en mostraxes persoais de bioaerosois como os filtros. Os impactadores usados para a captación de microorganismos ambientais poden ter dende unha simple fenda a máis de 400 buratos por plataforma (Millipore comercializa un impactador con orificios). As partículas impactan sobre o medio de crecemento onde, logo da incubación en condicións axeitadas, darán lugar á formación dunha colonia por cada microorganismo viable cultivable impactado. Non obstante, cando o número de partículas impactado é elevado, pode suceder que, sobre un mesmo sitio, impacten varias partículas, cada unha das cales contén un ou máis microorganismos, que poden ser inapropiadamente contados como unha colonia individual. A medida que o número de microorganismos depositados no medio de crecemento se incrementa, a probabilidade de que a próxima partícula que contén microorganismos impacte nun burato limpo diminúe. Por exemplo, se nun mostrador con 400 orificios de entrada están ocupados 200, a probabilidade de que a seguinte partícula atope un orificio libre é do 50%. Para corrixir estes erros debidos á coincidencia de impactación, estableceuse unha fórmula básica de corrección, que é a seguinte: 182

172 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) P r = N[ 1 N + 1 N n N- r + 1 ] Andersen (1958) e Leopold (1988) estableceron que P r son as partículas cultivables estimadas cando se observan na placa de mostraxe r colonias cultivables, e N é o número total de buratos por plataforma do impactador. Macher (1989) estableceu táboas de corrección para os impactadores de 200 e 400 buratos. Estas táboas asígnanlle a cada número de unidades formadoras de colonias (UFC) contabilizado sobre a placa de cultivo un valor probable de microorganismos ambientais cun intervalo de confianza do 95% (media ± 2 STD). A desviación faise maior para un mesmo mostrador conforme se incrementa o número de lugares ocupados. Por exemplo, para o caso dun mostrador con 200 orificios, cando sobre a placa se len 27 UFC, ese intervalo será de 29 ± 3 (26 a 32) e se a lectura é de 123 UFC, o intervalo é de 190'9 ± 11'2 (179'9-202'8). Para un mesmo número de UFC, a desviación é maior para o impactador de 200 buratos que para o de 400. Así, para unha lectura de 100 UFC, o número de microorganismos corrixidos que lles correspondería aos mostradores con 200 e 400 orificios serían de 138'6 ± 15'6 e de 115'0 ± 8'4, respectivamente. Os datos suxiren que, para evitar os erros debidos á coincidencia, é máis vantaxoso utilizar o mostrador con 400 buratos que o de 200. Dentro desta categoría de mostradores están algúns dos máis utilizados, como son os de Andersen, nas súas versións de 1, 2 e 6 niveis (nesta última versión é, ademais, considerado como mostrador de referencia), o SAS, Surface Air System Sampler, con 220 ou 260 orificios, o de Casella (figura 10) que unicamente ten unha rañura rectangular para a entrada de aire e a placa vai xirando no interior do mostrador a velocidade constante, e o RCS, Reuter Centrifugal Sampler, aínda que este último se basea na captación das partículas pola súa forza centrífuga (figura 9). 183

173 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) Filtración Outro dos sistemas comúns utilizados para a recolección de bioaerosois é a filtración. Consiste en facer pasar un volume determinado de aire a través dun medio de filtración sobre o que quedan retidas as partículas portadoras dos microorganismos. Os filtros, fabricados con diversos tipos de materiais (fibras, membranas ou xelatinas), teñen tamaños de poro que oscilan, xeralmente, entre 0'01 e 10 mm. A eficiencia para reter as partículas do aire depende da velocidade de impacto (é dicir, a velocidade do aire que cruza a sección do portador do filtro). Estes sistemas permiten recoller partículas máis pequenas que o tamaño de poro, aínda que para partículas menores que 1mm a eficiencia total diminúe co incremento da velocidade de impacto. Para partículas maiores que 1 mm, aproximadamente, a eficiencia de captación do filtro é maior que o 99%. A eficiencia total dos filtros de membrana é aproximadamente do 100% para partículas maiores que o tamaño de poro. A utilización da filtración é vantaxosa fronte á impactación en áreas altamente contaminadas. Os mostradores de bioaerosois que teñen como base a impactación satúranse con rapidez en áreas altamente contaminadas, polo que é necesario tomar numerosas mostras durante breves períodos de tempo, coa conseguinte variabilidade entre elas. Non obstante, a mostraxe por filtración non ten esta dificultade pois, no procesamento posterior, a mostra pode diluírse ata a concentración desexada. A filtración presenta vantaxes sobre outros métodos de mostraxe (Eduard et alii, 1990). Pode usarse para realizar mostraxes persoais mesmo durante a xornada completa, pois utiliza un equipo de mostraxe portátil similar ao que se emprega para a captación de metais ou po. Ademais, permite a utilización de diferentes métodos, complementarios entre si, para a valoración dos microorganismos captados. A mostra pode cuantificarse directamente mediante microscopía óptica ou electrónica ou, tras resuspensión e filtración, por microscopía de fluorescencia. Despois de resuspensión e dilución, pode cultivarse en diferentes medios. Por último, tamén permite a 184

174 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) análise de micotoxinas, o ensaio de endotoxinas ou a realización de probas para alérxenos específicos. Os filtros de membrana fabrícanse nunha gran variedade de tamaños de poro en polímeros tales como éster de celulosa, cloruro de polivinilo e policarbonatos. Estes filtros de membrana poliméricos carecen de rixidez polo que deben usarse xunto cun soporte de apoio. A elección dun filtro depende do contaminante de interese e dos requirimentos da técnica analítica. Para análises gravimétricas, selecciónanse materiais non higroscópicos, tales como fibra de vidro, prata ou membranas de cloruro de polivinilo. Para análise por microscopía elíxense, xeralmente, membranas de ésteres de celulosa ou policarbonatos. Os filtros de membrana poden facerse transparentes opticamente por inmersión nun medio adecuado para ser observados microscopicamente. O contido dos filtros tamén pode cultivarse situándoos directamente sobre placas de ágar, o que permite a utilización de análises baseadas no cultivo. Figura 9.- Esquema dos principais mostradores de impacto (de Arquer, 2000; AIHA, 1996) Impactador de Andersen de 6 niveis RCS Reuter Centrifugal System 185

175 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) SAS Surface Air Sampler Sección Transversal do mostrador SAS Os filtros mantéñense a miúdo en casetes plásticas desbotables durante a mostraxe dos bioaerosois. A casete está constituída por tres corpos e pode usarse aberta ou pechada. A mostraxe con casete aberta lévase a cabo retirando a última cuberta de plástico do de tres corpos, e úsase cando queremos que as partículas se depositen uniformemente sobre o filtro para realizar unha análise microscópica. Se se utiliza unha casete de tres corpos aberta, a cuberta debe conservarse para protexer o filtro unha vez concluída a mostraxe. Todas as casetes deben ensamblarse con seguridade e selarse as unións cunha banda elástica de teflón ou similar para previr a perda do filtro e a entrada de aire polas unións. Os filtros de membrana que se usan nas mostraxes teñen diámetros de 37 ou 47 mm. Como a presión a través do filtro se incrementa coa velocidade do aire, o uso dun filtro de maior tamaño, 47 mm, dá como consecuencias unha menor presión para unha velocidade de fluxo dada. O uso de filtros máis pequenos, 37 mm, concentra o depósito dos contaminantes nunha área menor, incrementando a densidade das partículas por unidade de área do filtro. Isto é útil para o exame microscópico directo daquelas mostras tomadas en áreas con baixas concentracións de microorganismos. Naquelas áreas que presentan unha elevada concentración, para poder realizar unha lectura microscópica das mostras, 186

176 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) os microorganismos presentes no filtro deben ser, primeiramente, eluídos, logo, diluídos e, finalmente, filtrados. Sobre os mostradores por filtración investigáronse modificacións que ofrecen certas vantaxes con respecto ao modelo básico. Así, o mostrador de aerosois Button (Button aerosol sampler), ademais de ter menor tamaño æutiliza un filtro de 25 mm como superficie de captaciónæ, presenta a particularidade de ter como entrada unha superficie porosa curva. Este deseño confírelle a este mostrador algunhas vantaxes sobre os mostradores de filtros de 37 mm convencionais como son unha menor sensibilidade ao vento e unha recolección de partículas uniforme sobre o filtro (Hauck et alii, 1997). Este mostrador, que nun principio se desenvolveu para mostraxe ambiental onde avantaxou aos mostradores sobre lámina de vidro recubertos dunha substancia adhesiva como o Air-O-Cell ou o Burkard (Aizenberg et alii, 2000 b), foi probado con éxito como mostrador persoal para bioaerosois inhalables (Aizenberg et alii, 2000a). Unha das principais desvantaxes que presenta a filtración é que os microorganismos están moi expostos ao desecamento, sobre todo en mostraxes longas. Non son apropiadas cando, para analizar a mostra, queiramos utilizar métodos baseados no cultivo pois perdemos aquelas especies sensibles ao desecamento (a maioría das bacteria non esporuladas, por exemplo). As técnicas de filtración utilízanse fundamentalmente para a toma de mostra de certo número de fungos e bacterias que forman endosporas, que son resistentes ao desecamento. A observación microscópica da mostra pode facerse directamente, como xa se mencionou, ou tras extraer os microorganismos mediante lavado. Eduard et alii (1990) utilizan 0'01% de Tween 80 como solución de lavado, e unha nova filtración para distribuílos uniformemente. Este último sistema presenta vantaxes sobre a observación directa xa que permite realizar dilucións no caso de que sexan necesarias e ademais durante o proceso prodúcese a desagregación de microorganismos o que facilita a súa cuantificación. 187

177 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) Cando se pretenden cultivar os microorganismos, os filtros de membrana de cada casete lávanse con 0'02% de TweenTM 20 en solución acuosa (tres lavados de 2 ml) con axitación (DHHS-NIOSH 1998). Outros autores, Eduard et alii (1990), utilizan 0'1% de peptona con 0'05% de Tween 80 e 2% de inositol. Parte do volume de lavado dilúese de forma seriada (1:10; 1:100; 1:1000) e inocúlanse 0,1 ml de cada dilución, por duplicado, en placas de Petri (100 mm x 15 mm) co medio de cultivo apropiado. Os microorganismos que quedan sobre o filtro cóntanse colocando o filtro nun medio de cultivo en placa de Petri que permite a súa colonización. Unha vez incubadas as placas de Petri, identifícanse e cóntanse as colonias. Este método de dilucións seriadas permite o reconto de esporas a niveis baixos ou elevados, incubando a mostra directamente ou diluída. Un problema inherente a este procedemento é que as dilucións analíticas elevadas poden excluír, estatisticamente, aqueles taxóns presentes en baixas concentracións no aire mostrado. A técnica de dilución favorece as poboacións de fungos predominantes a expensas das poboacións menores. Recollida en medio líquido Os burbulladores poden considerarse un tipo especial de impactador nos que se fai pasar un volume de aire determinado a través dun caldo de cultivo (solución de peptona) ou simplemente dunha solución salina isotónica. Os microorganismos quedarán retidos neste medio líquido. Os impingers, tales como o Greenberg-Smith ou o AGI-30 usan un líquido (p. e., unha solución salina tapada con 0'3 mm de fofato) como medio de captación. A adición a este medio de proteínas, antiespumantes e anticonxelantes preveñen a formación de escuma e a perda de líquido de captación, minimizándolles o dano ás células. Utilízanse normalmente para captar bioaerosois cultivables, especialmente bacterias. Moitas esporas fúnxicas son hidrófobas e flotan na superficie do líquido, polo que poden ser eliminadas co aire que sae. O sistema consta dun tubo capilar, deseñado para reducirlles o dano ás células cando o aire se dispersa no interior do líquido, que conduce a corrente de aire ata as proximidades da base do mostrador. 188

178 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) Os mostradores máis utilizados, Greenberg-Smith e AGI- 30, traballan a un caudal de 28'3 e 12'5 L/min. no tubo de entrada, respectivamente. A d 50 destes mostradores é aproximadamente 0'3 mm. No AGI-30 o tubo de entrada está curvado para simular a captación de partículas por vía nasal. Isto faino especialmente axeitado para o estudo de microorganismos infecciosos a través do aire, pois separa os microorganismos respirables (recollidos no fluído) e os non respirables (na entrada do tubo). Cando se usa para recuperar o total de microorganismos ambientais, é necesario lavar a curva do tubo de entrada cunha cantidade coñecida de líquido despois da mostraxe, para recuperar as partículas maiores (p. e., 15 mm ) que quedan retidas na parede interior do tubo. Despois da mostraxe, fíltranse 10 ml do líquido, previamente homoxeneizado por axitación, a través dun filtro de membrana de 0'45 mm de tamaño de poro. Pódense realizar dilucións seriadas do líquido de mostraxe restante. O filtro sitúase nunha placa de Petri estéril co medio de crecemento apropiado, e incúbase para realizar posteriormente a identificación e reconto dos microorganismos. A captación en medio líquido presenta algunhas vantaxes para a mostraxe de microorganismos cultivables. Ao se tratar dun medio líquido, os microorganismos non sofren problemas de desecamento, o que permite aumentar o tempo de mostraxe sempre que se teña a precaución de refrixerar o burbullador (Eduard e Heederik, 1998). Por outra banda, ao igual que os filtros, pode ser utilizado en áreas cunha elevada contaminación microbiolóxica pois as mostras poden diluírse convenientemente ata obter densidades axeitadas para o cultivo. Finalmente, estudos realizados sobre a posibilidade de enviar as mostras por correo (Thorne et alii, 1994) puxeron de manifesto que, o cultivo das bacterias, fermentos e mofos non se ve, en xeral, alterado sempre que se envíen refrixeradas. Características de varios mostradores de bioaerosois Unha vez determinado o obxectivo da mostraxe de bioaerosois, hai que elixir o método ou os métodos máis apropiados para realizalos. O mostrador de bioaerosol seleccionado 189

179 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) debe ser capaz de recoller as partículas, cunha alta eficacia, dentro das condicións físicas e biolóxicas requiridas polos microorganismos que van ser mostrados. Na táboa 8 indícanse as características tanto experimentais como teóricas dalgúns dos mostradores de bioaerosois máis utilizados. As características físicas (fluxo, diámetro do orificio ou ancho de fenda, área das tobeiras, e velocidade do aire a través da tobeira) úsanse para calcular os diámetros de corte teóricos dos mostradores. Ao avaliar os datos obtidos por un determinado mostrador, é moi importante a distribución por tamaño dos bioaerosois. Se o mostrador utilizado non proporciona datos sobre esa distribución, entón debemos usar tamén un impactador en fervenza, tal como o de Andersen de 6 niveis, para que nos proporcione información sobre a distribución das partículas por tamaño. Ademais, hai outros aspectos que van ter importancia á hora de decidir o mostrador que imos utilizar. No caso de ambientes altamente contaminados, os mostradores máis apropiados son os que se basean na filtración ou a captación no medio líquido, pois permiten a dilución das mostras. Para realizar mostraxes a baixas concentracións son moi apropiados os burbulladores, porque permiten mostrar durante períodos de tempo máis longos; tamén poderían utilizarse filtros, pero só no caso de bacterias resistentes ao desecamento ou de fungos. O equipo de mostraxe ha de adaptarse ás características dos microorganismos e ás técnicas de análise que desexamos utilizar. Os instrumentos para mostrar bioaerosois cultivables deben minimizar os danos durante o proceso de recollida e manter a capacidade de cultivo dos microorganismos recollidos. Así, por exemplo, se os microorganismos, como acontece con moitas bacterias que non forman esporas, non son resistentes ao desecamento, non poden mostrarse con filtros se pretendemos analizalos por métodos baseados no cultivo, xa que as células se desecarían e se volverían non viables ou viables, pero non cultivables. Para mostrar bioaerosois non viables, incluídas as partes ou substancias derivadas dos microorganismos (proteínas, toxinas, alérxenos, etc.) o mostrador máis apropiado é o 190

180 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) filtro de membranas, xa que o contido destes pode ser analizado por unha gran variedade de técnicas. Cando se mostran microorganismos non viables ou cando non interesa o seu cultivo, o que se busca fundamentalmente é a maior eficacia de captación. O tamaño do microorganismo e, máis concretamente o seu diámetro aerodinámico, van descartar a utilización de determinados mostradores. Por exemplo, para mostrar esporas de Aspergillus niger (d ae ª1-3 mm) non sería apropiado utilizar nin o SAS (d50 = 2'0 µm) nin o RCS (d 50 = 3'8 µm). No manual de métodos analíticos do NIOSH (DHHS- NIOSH 1998) hai unha guía xeral que serve de axuda á hora de elixir un mostrador adaptado ás características dos bioaerosois de interese (táboa 9), atendendo a que sexan cultivables ou non e ao seu tamaño. Utiliza como medida do tamaño o diámetro medio aerodinámico da masa (DMAM). O DMAM serve para describir a distribución da masa. Equivale ao diámetro no cal as partículas maiores que o devandito diámetro contribúen á metade da masa captada, mentres que as partículas de diámetro inferior contribúen á outra metade. As subcategorías inclúen bacterias libres (a maioría das células sinxelas), fungos libres (a maioría das esporas sinxelas), e bacterias e fungos agrupados con DMAM 4 mm. En ocasións, os bioaerosois poden estar formados por agrupacións de microorganismos ou por microorganismos fixados a outras partículas tales como unha escama de pel ou unha peza de fío. A norma UNE-EN tamén reflicte nunha táboa as vantaxes e limitacións dos diferentes métodos de mostraxe para a medida dos microorganismos non infecciosos na atmosfera de traballo, tanto daqueles que se basean en métodos de cultivo, coma daqueloutros que se basean noutras técnicas analíticas (microscopía óptica, de fluorescencia ou de varrido; ELISA; PCR; cromatografía de gasesespectrofotometría de masas; citometría de fluxo; ensaio do lisado de amebocito de límulo). Na devandita táboa indícanse ademais as entidades microbianas (microorganismos en xeral, esporas, actinomicetos, agregados cultivables, endotoxinas, antíxenos, ácidos graxos, etc.) para as que é 191

181 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) recomendable cada un dos devanditos métodos así como as atmosferas de traballo para as que son máis apropiados. Cando se usa un mostrador de bioaerosois cultivables, o hixienista debe seleccionar coidadosamente o tempo de mostraxe, en función da concentración estimada, co obxectivo final de obter unha concentración de colonias por placa, xa que este é o número de colonias óptimo para que o reconto se poida realizar sen dificultade, evitando problemas de solapamento. O límite inferior, 30 colonias, establécese baseándose en consideracións estatísticas, para que os datos poidan ser comparables cos obtidos noutras mostraxes e poder establecer a existencia ou non de variacións temporais ou espaciais. Cando se mostran ambientes con niveis moi baixos de bioaerosois cultivables, non se pode alcanzar o límite inferior de 30 colonias por placa e, nesta situación, débese utilizar unha representación cualitativa sen validez estatística. 192

182 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) TÁBOA 8. Características experimentais, teóricas e físicas de varios mostradores de bioaerosois Mostrador d 50 verdadero μm d 50 teórico μm # buratos Q L/min. D j o W j mm A j mm 2 Andersen 6-niveis Nivel Nivel Nivel Nivel Nivel Nivel Andersen 2-niveis Nivel Nivel Andersen 1-nivel (N6) Mattson-Garvin Slit-to-Agar AGI ,65 SAS Compact Standard RCS Standard RCS-Plus Impactador persoal en fervenza de Marple Nivel Nivel Nivel Nivel Nivel Nivel Nivel Nivel U j m/s Onde: d 50 = diámetro de corte ou diámetro aerodinámico por enriba do cal a eficiencia do impactador se aproxima ao 100%. Q = Caudal de mostraxe. D= Diámetro do tamiz ou burato. W j = Ancho da rañura. A j = Área do burato ou da rañura. U j = Velocidade do aire a través do burato ou rañura. Tomado de NMAM NIOSH (1998) e modificado segundo datos de Rubow et alii (1987) 193

183 MEDICIÓN DOS AXENTES BIOLÓXICOS (BIOAEROSOIS) TÁBOA 9. Guía xeral para axeitar o mostrador ao bioaerosol de interese Mostrador Mostras de bioaerosois cultivables Bacterias libres DMAM<4μm Fungos libres DMAM<4μm Bioaerosois non viables Agregados DMAM 4μm Bioaerosois DMAM<4μm Andersen 6-Nivel A A A Andersen 2-Nivel A A A Andersen 1-Nivel A A A,G Mattson-Garvin Slit-to-Agar A A A AGI-30 C,D C,D D,E SAS Compact B Standard B RCS Standard B RCS-Plus B Mostrador de C,F C C C C filtro de membrana Impinger C,D C,D E A B C D E F G = Satisfactorio para a aplicación especificada. = Concentracións superiores a u.f.c./m 3 saturarán a mostra. = Concentracións superiores a u.f.c./m 3 saturarán a mostra. = Bos para cualquera concentración. = Os bioaerosois poden ser reaerosolizados e saír do impinger durante a mostraxe, producindo unha baixa estimación da concentración e unha baixa precisión. = Pode dar concentracións altas debido á rotura dos agregados. = Só para bacterias resistentes ao desecamento. = Pode subestimar a concentración de grandes bioaerosois (DMAM>10 µm) debido a perdas á entrada do impactador. Tomado de NMAM NIOSH (1998) 194

184 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL

185 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL A continuación imos describir os sistemas de mostraxe ambiental e para iso, ademais de nos referir ao seu modo de funcionamento, ao fluxo de aire durante a mostra e aos tempos de mostraxe, imos definir tamén unha serie de parámetros de grande importancia á hora de seleccionar un determinado mostrador: o diámetro de corte (d 50 ), o límite de detección e o límite superior de cuantificación. O límite de detección (LDD) O límite de detección dun mostrador pode definirse como a concentración mínima de bioaerosois que é capaz de detectar. O límite de detección é función do tipo de mostrador usado, do volume de aire mostrado, pero tamén do procedemento de detección empregado. No caso de bioaerosois cultivables, o evento significativo é o número de unidades formadoras de colonias (UFC) atopadas nos cultivos. Usando o valor dunha UFC/m 3, e tendo en conta o tempo de mostraxe nominal e os fluxos específicos para cada tipo de mostrador, así como os pasos de dilución que se realicen, pódense calcular os LDD. Veremos no seu momento como se realiza este cálculo. Os valores obtidos poden axustarse para outros tempos de mostraxe ou, no caso do impinger líquido, ciclóns lavadores e casete con filtro, outros volumes de extracción ou dilución. Rango do límite superior (RLS) Podemos definir o rango do límite superior como aquela concentración ambiental máxima que un determinado mostrador é capaz de captar sen que se produzan problemas de saturación da mostra. Será maior canto maior sexa o volume de aire que permita captar, aínda que hai que ter en conta os problemas de solapamento que se producen cando as UFC superan unha determinada densidade. Recoméndase non superar as 5 UFC/cm 2 sobre a placa, aínda que este número vai depender do medio de cultivo utilizado e do método de reconto. Canto menor sexa o diámetro das colonias e maior a sensibilidade do método, maior poderá ser a densidade de colonias na superficie do cultivo e, xa que logo, maior o rango do límite superior. 197

186 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL Normalmente os fungos permiten densidades menores xa que tenden a formar colonias de maior tamaño. Non se asignaron límites superiores para filtro, burbullador e ciclón lavador, xa que o medio de extracción do filtro, o medio de mostraxe do burbullador ou o líquido de recolección do ciclón lavador poden diluírse de modo adecuado para acomodalos a niveis relativamente altos de UFC/m 3. Así pois, estes mostradores son adecuados para usalos en áreas fortemente contaminadas onde a concentración de bioaerosois pode exceder as 106 UFC/m 3. Limite de cuantificación (LDC). Podemos definir o límite de cuantificación como a concentración ambiental mínima que un mostrador pode captar para que os resultados sexan representativos. Considérase que un mínimo de 30 colonias é un número aceptable para estimar cunha precisión razoable o número e tipo de microorganismos presentes no ambiente. Esta estimación baséase no estatístico de Poisson e correspóndese a un coeficiente de variación (C.V.) de 0'2. Tendo en conta este número mínimo de 30 UFC por placa, o límite de cuantificación estimado para un mostrador será 30 veces o seu límite de detección. Abonde lembrar que o límite de detección se definía a partir da aparición dunha UFC Así, por exemplo, o límite de cuantificación para o burbullador no medio líquido será: LDD impinger = 53 UFC/m 3 LDC impinger = 30 x LDD impinger = 30 x 53 UFC/m 3 = 1590 UFC/m 3 ~ 2000 UFC/m 3 SISTEMAS DE MOSTRAXE POR IMPACTACIÓN Recolector de Andersen. O mostrador de Andersen (Andersen, 1958) é un impactador en fervenza de seis niveis que funciona a un fluxo de 28'3 litros/min. O mostrador está deseñado para separar os microorganismos en función do seu diámetro aerodinámico. 198

187 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL As placas de cultivo colócanse de forma que o aire, ao pasar dun nivel a outro, atravesa unhas placas con 400 orificios de diámetros progresivamente decrecentes. Os diámetros de corte teóricos dos niveis están comprendidos entre 0'58 µm, do sexto nivel, e 6'24 µm, do primeiro. Na táboa 8 indicáronse tanto os d 50 teóricos como reais que, como se sinalou anteriormente, dependen fundamentalmente da velocidade de aire en cada nivel, que é función do diámetro dos orificios. Os microorganismos deposítanse sobre as placas de ágar que se atopan en cada un dos niveis, en función do seu diámetro aerodinámico. Tomando como base o mostrador de seis niveis, deseñáronse os mostradores de dous niveis e o dun só nivel (N 6). O mostrador Andersen de dous niveis ten só 200 orificios por nivel e separa os microorganismos en dúas fraccións: a respirable e a non respirable (Guillespie et alii, 1981). Os diámetros de corte teóricos son de 6'28 µm para o primeiro nivel e de 0'83 µm para o segundo, que é o que capta a fracción respirable. Guillespie et alii (1981) descubriron que este mostrador, comparándoo co mostrador de seis niveis, infraestima os valores de concentración ambiental de microorganismos. O mostrador de Andersen dun só nivel (N 6) (Jones et alii, 1985) utilízase cando se quere contabilizar o número total de microorganismos viables, sen diferenciar por tamaño. Este mostrador consta dunha placa perforada con 400 buratos, semellante á do nivel 6 do mostrador de Andersen de seis niveis. Como o fluxo de aire durante a mostraxe é de 28'3 litro/min. os diámetros de corte teórico e verdadeiro son 0'58 e 0'65 µm respectivamente, os mesmos que os do último nivel do mostrador de seis niveis. O mostrador de Andersen de 1 nivel, tamén denominado N6, presenta como vantaxe sobre o de seis niveis que só hai que cultivar unha placa e simplifícase o manexo das mostras e a limpeza do mostrador. Como a impactación se produce sobre un único nivel, as perdas potenciais sobre as paredes son menores. As desvantaxes que presenta refírense a que non proporciona ningunha información sobre a distribución dos bioaerosois 199

188 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL por tamaños e a que se producen maior número de solapamentos, sobre todo en áreas con alta contaminación. Os diferentes tipos de mostradores Andersen son moi apropiados para a mostraxe de microorganismos cultivables. No caso de querer diferenciar a fracción respirable e a fracción non respirable deben de utilizarse os mostradores de dous ou seis niveis, e este último é especialmente recomendable cando queiramos obter unha información máis detallada sobre a distribución dos bioaerosois por tamaños. Se unicamente nos interesa cuantificar o número de microorganismos cultivables, expresados como UFC/m 3, independentemente do seu tamaño, entón debemos utilizar o mostrador dun só nivel (N 6), xa que deste modo reduciremos o investimento en material e tempo. En todo caso, o número de colonias contadas debe axustarse para corrixir o efecto de coincidencia de impactación, é dicir, a probabilidade de que dous ou máis bioaerosois portadores de microorganismos cultivables impacten nun mesmo lugar e dean lugar a unha única colonia (Leopold, 1988; Macher, 1989). Este tipo de mostradores non resultan apropiados para mostrar zonas de baixa contaminación. O tempo máximo de mostraxe recomendada é de 5 minutos. O volume de aire mostrado neste período, tendo en conta que funciona a un fluxo de 28'3 litro/min., é de 141'5 litros. Detectaremos a presenza de contaminación biolóxica cando, logo da incubación da placa, se observe, polo menos, unha colonia. Para o mostrador de Andersen, isto quere dicir que nos 141'5 litros captamos 1 microorganismo viable. Se estes valores os trasladamos para un volume de 1 m 3, obteñen unha concentración teórica 7 UFC/m 3, que será a concentración mínima que podemos detectar e, polo tanto, determina a sensibilidade do mostrador. Debe notarse, non obstante, que a concentracións tan baixas corremos aínda o risco de non captar ningún bioaerosol cultivable co que, para un ambiente con baixa contaminación biolóxica, poderiamos obter un resultado de 0 UFC/m 3. O límite superior deste tipo de mostradores depende das características do mostrador: número de niveis que ten e do 200

189 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL número de orificios. O enmascaramento entre colonias depende do número de orificios e da súa distribución. Para minimizar o solapamento entre as colonias debe evitarse que crezan en diámetros superiores á separación entre os buratos (AIHA, 1996). Este diámetro varía de 1 a 3 mm, segundo o tipo de impactador, e dun nivel a outro para un impactador en fervenza. Seguindo as táboas de Macher (1989), cando nas placas obtidas polo mostrador de seis niveis e polo N6, que teñen 400 orificios por nivel, se observa o crecemento de 400 colonias, o valor corrixido é de ± 510 UFC e, cando crecen 200 colonias nas placas obtidas do mostrador de 2 niveis (200 buratos por nivel), o valor corrixido é de ± 254 UFC. Se mostramos durante un minuto, é dicir, 28'3 litros, os valores anteriores corresponderíanse con UFC/m3 (±18.021), para cada un dos niveis do mostrador de 6 niveis ou para o N6, e de UFC/m 3 (±8.975) para o mostrador de dous niveis. Estes son valores teóricos porque, como é obvio, unha vez que se produciu impactación en todos os orificios, calquera outro microorganismo que sexa recollido vai impactar sobre un lugar xa ocupado e non saberemos se a concentración ambiental é a máxima indicada nas táboas ou, pola contra, moi superior a ela. Se sucede isto, ten que reducirse o tempo de mostraxe. Do anteriormente indicado dedúcese que, en lugares con elevada contaminación biolóxica, é vantaxoso utilizar un mostrador con 400 buratos xa que ten máis lugares dispoñibles para a impactación. O máis apropiado sería o mostrador de Andersen de 6 niveis pois os microorganismos repártense entre todos os niveis. Se diminuímos o tempo de mostraxe, aumentaremos o límite superior de cuantificación. Así, se reducimos o tempo de mostraxe á metade (0'5 minutos), tomamos 14'15 litros de aire e os límites superiores de cuantificación multiplicaranse por dous. 201

190 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL Recolector RCS (Reuter Centrifugal System) Neste mostrador unha hélice impulsa o aire sobre unha fita que contén medio de cultivo axeitado, distribuído nunha serie de alvéolos superpostos. Os bioaerosois impactan por acción da forza centrífuga sobre o medio de cultivo. Existen dous modelos diferentes, o RCS orixinal, que mostra a un fluxo de 40 litros/min., e o RCS PLUS, que o fai a 50 litros/min. No primeiro, o tempo de mostraxe pode seleccionarse entre 30 segundos e 8 minutos. Con estas condicións, 40 litros/min. e 8 minutos, o límite de detección para o RCS orixinal será de 1 colonia/320 litros, é dicir, aproximadamente 3 UFC/m 3. No modelo orixinal, o aire entra e sae polo mesmo lugar. Macher e First (1983) estimaron que o fluxo real podería ser moi superior ao que indica o fabricante, mesmo superior a 200 litros/min., co que se reduciría moito a eficiencia de captación para as partículas de menor tamaño. As partículas menores de 2 µm non serían recollidas. No RCS PLUS a entrada e a saída de aire son independentes. Está deseñado para mostrar volumes de aire que oscilan entre 1 e litros. O límite de detección neste caso será de 1 colonia/1.000 litros, é dicir, 1 UFC/m 3. Non obstante, para alcanzar un volume de mostraxe de litros son necesarios 20 minutos e isto pode reducir a viabilidade dos microorganismos por desecamento. Nestes impactadores as partículas localízanse ao chou sobre a fita. O límite superior de cuantificación vai depender da proximidade das partículas impactadas e das súas características de crecemento. Se tomamos a densidade óptima en placa de 5 colonias/cm 2 como densidade máxima que debe alcanzar logo da mostraxe para evitar o sobrecrecemento e os efectos das toxinas dunhas colonias sobre as outras, podemos calcular a concentración ambiental máxima que pode mostrarse co RCS. Como a banda de cultivo do RCS ten unha superficie de 34 cm 2, poderían contabilizarse ata 170 colonias logo do cultivo. Se este número máximo de colonias o obtivésemos no tempo mínimo de 202

191 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL mostraxe (0'5 min.), obteriamos o límite superior, que sería de 170 UFC por 20 litros, é dicir, UFC/ m 3. 5 UFC/cm 2 x 34 cm 2 = 170 UFC 170 UFC/20 litros aire = 170 UFC/0 02 m 3 de aire = UFC/m 3 El RCS PLUS, que permite un volume mínimo de mostraxe de 1 litro, tería un límite superior de 170 UFC/litro, ou o que é o mesmo, UFC/m UFC/1 litro aire = 170 UFC/0 001 m 3 = UFC/m 3 Mostrador SAS (Surface Air Sampler) É un impactador dun só nivel no que o aire atravesa unha placa perforada con 219 ou 260 buratos de 1 mm de diámetro, segundo o modelo (existen versións con 487 buratos). Hai tres versións dispoñibles: Portable Compact Model 6873 e Super 90, que mostran 90 litros/min., e o Portable High Flow Model 5203, que funciona a un fluxo de 180 litros/min. Posibilita mostrar dentro dunha ampla marxe de volumes de aire xa que o tempo de mostraxe pode seleccionarse entre os 20 segundos e os 5 minutos, sempre en intervalos de 20 segundos. Así pois, o caudal mínimo será de 30 litros (20 segundos a un fluxo de 90 litros/min.), e o máximo de 900 litros (5 minutos a 180 litros/min.). O d 50 que se observou para este mostrador é de 2 µm, o que o fai apropiado, sobre todo, para mostrar os bioaerosois de maior tamaño (agregados). A súa eficiencia baixa moito cando no ambiente os bioaerosois se corresponden con bacterias ou fungos libres. Smid et alii (1989), comparando os mostradores Andersen N6, Slit (mostrador de rañura), RCS e o SAS con respecto á cuantificación de fungos viables en ambientes laborais, descubriron que o mostrador SAS infraestima o número de UFC en aproximadamente un 50%. 203

192 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL O límite de detección depende das características de cada un dos modelos. Para o tempo de mostraxe máxima recomendada (5 minutos), os LDD previstos son de 2 UFC/m 3 para os modelos Compacto e Super 90 e de 1 UFC/m 3 para o modelo High Flow. Para facer o cálculo temos que lembrar que debe de contabilizarse unha unidade formadora de colonias (UFC) sobre a placa. Modelos Compact e Super90: 90 litros/min x 5 min = 450 litros = m 3 ; 1 UFC/0 450 m 3 ~ 2 UFC/m 3 Modelo High Flow: 180 litros/min x 5 min = 900 litros = m 3 ; 1 UFC/ m 3 ~ 1 UFC/m 3 Non obstante, debe terse en conta que, para volumes de aire elevados ( litros), a viabilidade dos microorganismos recollidos pode verse reducida a causa do desecamento. As estimacións do límite superior han de facerse sobre a base das suposicións feitas para o mostrador Andersen. Se o número de colonias máximas distinguibles é igual ao número de buratos, 219 ou 487, debe corrixirse o reconto. Para o modelo Compact de 219 buratos, cando se produce crecemento de colonias nos 219 lugares de impactación, estímase que se corresponde cun valor corrixido de UFC. O límite superior da concentración, para o tempo mínimo de mostraxe recomendada de 20 segundos (30 litros de aire para un fluxo de 90 litros/min.), é de UFC/m UFC/30 litros = UFC /m 3 Para o mostrador Super 90, de 219 buratos, o volume mínimo recomendado de mostraxe é de 10 litros, o que se corresponde cun límite superior de UFC/m 3. Para o mostrador High flow, cun fluxo de 180 litros/min. e un tempo mínimo de mostraxe de 20 segundos (60 litros de aire), o límite superior estimado é de aproximadamente UFC/m 3. Para as versións de 487 buratos os límites superiores son aproximadamente o dobre. 204

193 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL Estes mostradores son doados de manexar e permiten seleccionar entre unha gran variedade de medios de cultivo. Como desvantaxe principal hai que destacar a baixa eficacia na captación de bioaerosois de pequeno tamaño, e o feito de que as medicións realizadas en ambientes moi secos e con temperaturas elevadas ou velocidades de vento altas poden ocasionar desecamento do medio de cultivo. Mostreador de fenda (Casella) O aire atravesa un estreita fenda e impacta nunha placa de Petri dotada dun movemento uniforme de rotación cunha velocidade que se axusta en función da densidade da poboación microbiana (figura 10). Este mostrador, cunha alta eficacia de captación, ten unha serie de vantaxes: diseminación uniforme de microorganismos sobre a superficie do ágar, permite o estudo consecutivo de numerosas mostras e o propio técnico pode cubrir as súas necesidades de medios selectivos de cultivo. A distribución das UFC nunha superficie de captación dun mostrador de rañura reflicte cambios temporais na variación da concentración do bioaerosol que poden relacionarse con actividades específicas no tempo de toma de mostra. A principal desvantaxe é o risco de desecamento dos microorganismos en estado vexetativo, especialmente cando as temperaturas son elevadas. Non obstante, nestes mostradores o ágar utilizado como superficie de impactación perde menos auga que noutros impactadores xa que, ao estar placa a rotar continuamente baixo a entrada, o tempo de exposición á corrente de aire é menor. Nos modelos actuais, Casella comercializa un cuxo caudal de mostraxe pode regularse entre 30 e 700 litros por minuto, co cal o límite de detección baixa moito para caudais elevados e permite a aplicación deste mostrador a zonas de baixa contaminación. 205

194 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL Figura 10.- Mostrador de Casella Outros mostradores de impacto No mercado existen outros mostradores que incorporan algunhas das técnicas antes citadas. O de Millipore, M Air T, recolle os microorganismos por impacto sobre placas de ágar (figura 11). A entrada do aire no mostrador prodúcese a través dunha placa con aproximadamente microperforacións co que se reduce o risco de solapamento entre as colonias. Traballa a un caudal de litros/minuto para un volume máximo de mostraxe de litros. Para este volume máximo, o límite de detección sería, pois, de 1 UFC/m

195 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL Figura 11.- Mostrador M air T (Millipore) O mostrador de Merck, MAIS-100 (figura 12), traballa a un caudal de 100 litros/minuto para un volume máximo de mostraxe de litros. Ten programados volumes de mostraxe de 10, 20, 50, 100, 200, 250, 500, 750 e litros. Incorpora unha reixa de 400 buratos. A cabeza de mostraxe é axustable, co que permite medir tanto en posición horizontal como vertical. A velocidade do aire é de 0'45 m/segundo en aspiración horizontal. 207

196 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL Figura 12.- Mostrador MAS-100 (Merck) 208

197 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL SISTEMA DE MOSTRAXE POR BURBULLO EN MEDIO LÍQUIDO Como xa vimos, este sistema basea o seu funcionamento en facer pasar un volume determinado de aire en forma de burbullas a través dun caldo de cultivo ou solución isotónica, nos cales quedan retidos os microorganismos. O reconto de microorganismos realízase a partir dunha sementeira de alícuotas da mostra, podendo utilizar a continuación as distintas técnicas de análise cuantitativa (número máis probable, sementeira en ágar, filtración). O líquido elíxese, sobre todo, en función do método analítico que se quere utilizar. A norma UNE-EN tamén dá unhas indicacións a este respecto (táboa 10). TÁBOA 10. Indicacións para a selección dun burbullador Método de mostraxe Instrumento Substrato Método analítico Entidad microbiana Atmosferas A maioría das atmosferas de traballo Burbullador Disolución captadora: NaCl ao 9% en auga, betaína, peptona Cultivo Agregados cultivables dos microorganismos A observación dunha especie é importante para a fuente Identificación en atmosferas interiores Peptona ao 1% Citometría de fluxo Microorganismos Cortellos Un dos burbulladores máis utilizados é o AGI-30 (All glass impinger). O fluxo deste mostrador calíbrase a 12'5 litros/minuto. Está deseñado cunha curva no conduto de entrada de aire para atrapar as partículas maiores, que que- 209

198 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL darían retidas nas vías aéreas superiores. O diámetro de corte teórico é de 0'30 µm. Tamén existen burbulladores con varios niveis. O Burkard May-Type Multi Stage Impinger ten tres niveis con diámetros de corte de 1, 4 e 10 µm e funciona a fluxos de 20 e 55 litros/minuto. Ao utilizar este tipo de mostradores non se corre o perigo de desecamento que existe con outros mostradores. Non obstante, non pode descartarse a posibilidade de que se produza proliferación bacteriana no seo do líquido durante a mostraxe e o almacenamento. Considerando que un impinger líquido contén 20 ml de medio de captura e que o tempo típico de mostraxe é de 30 minutos, a un fluxo de 12'5 litro/min., temos que o volume de aire mostrado é de 375 litros (0'375 m 3 ). Supoñendo que se utiliza 1 ml deses 20 para inocular unha placa de ágar, a incubación e subseguinte crecemento dunha UFC debería corresponder a 20 UFC nos 20 ml e, polo tanto, nos 0'375 m 3 de aire mostrados. Así pois, a concentración ambiental será de 53 UFC/m 3, que se corresponde, pola súa vez, co límite de detección. Este límite podería rebaixarse se filtramos todo o contido do burbullador e posteriormente sementamos o filtro. Así conseguiriamos detectar unha UFC nos 0'375 m 3, que se corresponde con aproximadamente 3 UFC/m 3. O líquido de captura do burbullador pode diluírse, polo que resulta moi apropiado para mostrar áreas de elevada contaminación, onde a concentración de bioaerosois pode exceder as 10 6 UFC/m 3. O rango do límite superior é moi elevado SISTEMAS DE MOSTRAXE POR FILTRACIÓN Estes métodos que, como vimos, se basean en facer pasar un volume determinado de aire a través dun filtro no cal quedan retidas as partículas portadoras de microorganismos, son moi axeitados para mostrar áreas de elevada contaminación biolóxica xa que permiten captar grandes volumes. Algúns autores (Eduard e Heederik, 1988) recomendan o seu uso baseándose en que poden ser analizados por unha 210

199 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL gran variedade de métodos que non se basean no cultivo e en que, dada a súa manexabilidade, permiten realizar mostraxes persoais dentro dun amplo rango de tempos de mostraxe. A filtración é o método que se utiliza para a mostraxe de constituíntes microbianos como as endotoxinas, glucanos e micotoxinas. No caso dos microorganismos cultivables non deben de utilizarse para as bacterias sensibles ao desecamento, sobre todo en períodos de mostraxe prolongados con volumes de aire superiores aos 250 litros. Para cultivar os microorganismos, estes poden levarse directamente sobre un medio de cultivo ou ben lavarse (no caso dos filtros de xelatina, o filtro pode disolverse en líquidos apropiados) para realizar posteriormente sementeiras do líquido de lavado nun medio de crecemento. Nunha mostraxe típica de 30 minutos a un fluxo de aire de 4 litros/min., mostrariamos 120 litros. Se, despois de extraer os microorganismos capturados en 5 ml de líquido, sementamos 1 ml, o LDD predito é de 42 UFC/m min x 4 l/min = 120 l = m 3 1 UFC/ml fi 5 UFC/5 ml ~ 5 UFC/0 120 m 3 fi 42 UFC/m 3. O rango do límite superior, como no caso do burbullador, pode ampliarse practicando dilucións, pero, neste caso, atopámonos coa limitación imposta pola sensibilidade de determinados microorganismos ao desecamento, que obriga a limitar o tempo de mostraxe. Na mostraxe por filtración, a elección do tipo de filtro que se vai utilizar faise en función do método analítico que se vai empregar e dos axentes biolóxicos ou os seus produtos que se van mostrar. Na táboa 11 indícanse as recomendacións que, sobre este particular, dá a norma UNE-EN

200 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL TÁBOA 11. Indicacións para a elección de filtros Método de mostraxe Instrumento Substrato MICROORGANISMOS Método analítico Microscopía de fluorescencia Entidade microbiana Microorganismos Mostrador con filtro para a fracción inhalable Filtro de policarbonato ( µm) Microscopía electrónica de barrido Cultivo Esporas de fungos e actinomicetos Agregados cultivables de microorganismos Filtro de éster de celulosa (0 8 µm) Microscopía óptica Microorganismos, especialmente esporas de fungos Filtro de xelatina (3 µm) Cultivo Agregados cultivables dos microorganismos PRODUTOS MICROBIANOS Mostrador con filtro para a fracción inhalable. Fibra de vidro Politetrafluoretileno Policloruro de vinilo Policarbonato Éster de celulosa LAL (a) Endotoxinas Portafiltros normalizados de aerosois para baixa velocidade do aire e tamaño de partícula <30 µm Fibra de vidro Politetrafluoretileno Policarbonato Fibra de vidro Éster de celulosa LAL (a) ELISA (b) PCR (c) CG-MS (d) (a) Ensaio do lisado do amebocito do Limulus (b) Ensaio inmunoenzimático (ELISA) (c) Reacción na cadea da polimerasa (d) Cromatografía de gases-espectrometría de masas Glucanos Antíxenos microbianos Marcadores moleculares Ácidos grasos 3- hidroxi Ergosterol Ácido murámico 212

201 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL MOSTRADORES PERSOAIS A partir dos mostradores ambientais anteriores desenvolvéronse unha serie de mostradores persoais. Este tipo de mostradores permiten obter medidas máis axustadas á exposición real que soporta o traballador. Poden mesmo distinguir variacións nos niveis de exposición como consecuencia de determinadas prácticas individuais que poden incrementar ou diminuír a exposición. Os mostradores persoais para axentes biolóxicos deben de ser eficientes á hora de capturar partículas menores de 1 µm. Tamén deben ser capaces de manter a viabilidade da mostra (Macher e First, 1984). Ademais deben de reunir outras características que son comúns con mostradores persoais para substancias químicas: robustez, facilidade de manexo, pequeno tamaño e lixeireza. Estes instrumentos conéctanse a unha bomba de mostraxe persoal que permite a liberdade de movementos do traballador. Deseñáronse numerosos mostradores persoais, aproveitando os principios de captación xa vistos: impactación, filtración e burbullo (Macher e First, 1984). De entre todos eles, os filtros son os máis populares xa que son moi manexables e permiten a mostraxe de grandes volumes de aire. O funcionamento destes mostradores con filtros para axentes biolóxicos é basicamente o mesmo que o dos utilizados para a mostraxe de axentes químicos. O grande inconveniente deste tipo de mostraxe é que, sobre todo cando se prolonga no tempo, os microorganismos que están expostos ao paso das correntes de aire soportan procesos de deshidratación que ocasionan danos ou mesmo a morte de moitos deles. Para previr en parte estes efectos utilizáronse filtros de xelatina que permiten manter certa humidade sobre a superficie. Non obstante, tampouco resultan satisfactorios para illar bacterias sensibles ao desecamento. A vantaxe dos filtros de xelatina sobre outros medios é que permiten obter información sobre o número de partículas que conteñen microorganismos, así como sobre o número total de microorganismos. O filtro de xelatina pode situarse directamente sobre ágar morno, onde se disolve e se absorbe, obténdose 213

202 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL así unha colonia por partícula depositada. Se se opta por disolver o filtro en auga ou nunha solución salina, as partículas que contén quedan liberadas no líquido e, por axitación, poden separarse os microorganismos. Así pode contarse o número total de microorganismos e, ademais, evítanse problemas de saturación do filtro (Macher e First, 1984). Os mesmos autores avaliaron as posibilidades que ofrecían outros mostradores persoais: burbulladores en medio líquido, mostrador espiral e impactador en fervenza. Os autores compararon a eficiencia de captura de cada un dos mostradores coa que presentaba o AGI-30 ou o mostrador de Andersen. Os burbulladores persoais han de funcionar a fluxos baixos, aproximadamente 1 litro/minuto, co que a eficiencia de mostraxe diminúe, sobre todo para partículas de pequeno tamaño. Tampouco o mostrador espiral presenta boas eficiencias de captación para partículas menores de 1 µm. Neste mostrador o aire percorre un conduto espiral cara ao centro do mostrador e as partículas, pola súa forza centrífuga, quedan retidas na banda exterior que recobre a parede en función do seu tamaño, as maiores deposítanse preto da entrada e as máis pequenas cara ao centro. Un dos mostradores persoais cuxas características foron ben estudadas é o impactador en fervenza de Marple, Marple Personal Cascade Impactor (Rubow et alii, 1987). O seu funcionamento baséase no principio de impactación e clasifica as partículas en función do seu diámetro aerodinámico. Comercialízase en diferentes versións, como un impactador de catro, seis ou oito niveis (modelos 294, 296 ou 298). O modelo 294 usa os niveis 1, 2, 3 e 5; e o modelo 296 utiliza os niveis do 3 ao 8. Os puntos de corte van de 0'5 µm a 21 µm. Está deseñado para funcionar a un fluxo de 2 litros/min., que é compatible coa utilización das bombas convencionais de mostraxe persoal. As tobeiras dos niveis un a seis son rañuras que se dispoñen de forma radial, seis rañuras por nivel, e as dos niveis sete e oito están constituídas por doce orificios circulares distribuídos en seis radios (dous orificios en cada radio). A distribución destas tobeiras é tal que permite que a área que existe entre as tobeiras dun 214

203 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL determinado nivel pode ser utilizada como superficie de impactación para as partículas que atravesan o nivel superior. Os parámetros de deseño e os diámetros de corte poden verse na táboa 8. O funcionamento é similar ao de calquera impactador en fervenza. As partículas maiores que o punto de corte para cada nivel son recollidas nese nivel. Os substratos son discos circulares (comercialízanse os substratos Mylar ou aceiro inoxidable) dun diámetro de 34 mm, coas mesmas tobeiras que as placas. As partículas menores que o último diámetro de corte son recollidas nun filtro final de 34 mm de diámetro que se atopa na base do impactador. A eficiencia da mostraxe é elevada, maior do 90% para partículas menores de 7 µm de diámetro e do 84% para aquelas de 10 µm. Para as partículas maiores a eficiencia diminúe ata o 56 a 64% para aquelas que teñen un diámetro de 20 µm. Este mostrador tamén foi probado substituíndo os substratos comerciais por un medio que contén xelatina, e os resultados comparáronse cos obtidos utilizando o filtro con medio Mylar como substrato de captura (Macher e Hansson, 1987). Os diámetros de corte (d 50 ) foron, para os niveis 4 a 7, de 5'2, 3'4, 1'4 e 1'0 µm con medio Mylar e de 5'9, 4'0, 1'6 e 1'0 µm para a bandexa con xelatina. A separación por tamaños é comparable á obtida co mostrador de Andersen. Se consideramos un tempo de mostraxe de 30 minutos, a un fluxo de 2 litros/min., o límite de detección será de 17 UFC/m 3 para cada nivel. 2 litros/min x 30 min = 60 litros = m 3 ; 1 UFC/0 060 m 3 ~ 17 UFC/m 3 O seu límite de cuantificación será de 500 UFC/ m 3. 2 litros/min x 30 min = 60 litros = m 3 ; 30 UFC/0 060 m 3 ~ 500 UFC/m 3 215

204 DESCRICIÓN DOS SISTEMAS DE MOSTRAXE AMBIENTAL Este mostrador pode usarse como mostrador ambiental cando os mostradores en fervenza tradicionais, que funcionan a 28 litros/min., se saturan con rapidez. TÉCNICAS DE MOSTRAXE EN SUPERFICIES A mostraxe de superficies ten especial interese á hora de establecer posibles contaminacións de produtos e materias primas a partir de instrumentos de traballo, roupas, mobiliario, elementos de construción, etc., que, polas súas características ou ben a causa dunha deficiente desinfección, actúen como posibles reservorios de contaminantes biolóxicos. Os procedementos básicos para a mostraxe de superficies son a mostraxe mediante placa de contacto e o frotis. Placa de contacto Frotis Na placa atópase un medio de cultivo solidificado e en lixeiro exceso, seleccionado en función dos microorganismos buscados. Colócase esta placa sobre a superficie en cuestión e prémese sobre esta, mantendo a placa inmóbil durante o contacto. Este método baséase na utilización de bólas estériles de algodón, que nos permite mostrar en zonas de difícil acceso para as placas de contacto. Coas bólas de algodón realízase posteriormente unha sementeira por extensión nunha placa con medio sólido ou ben introdúcese nunha solución isotónica estéril con axitación, realizando posteriormente sementeiras no medio sólido a partir desta solución. 216

205 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES

206 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES Para a determinación de propágulos de fungos (por exemplo esporas ou fragmentos de hifas capaces de producir colonias) e de células bacterianas e as súas esporas empréganse métodos de mostraxe e análises similares, pois as dificultades tamén son comúns aos dous tipos de microorganismos: selección do medio de cultivo, variabilidade temporal das concentracións, identificación a nivel de especie, etc. A identificación do organismo ten unha importancia especial na interpretación dos resultados. MOSTRAXE DE FUNGOS VIABLES EN AIRE As partículas impactadas sobre o medio de cultivo nos mostradores de bioaerosois proporcionan información sobre os fungos cultivables (viables). Pero estas mostras poden infraestimar o número de propágulos totais presentes por varias razóns: Só unha parte dos microorganismos presentes no ambiente son viables. A viabilidade dos propágulos diminúe co tempo e coa exposición ás condicións ambientais. No caso das esporas fúnxicas a súa viabilidade diminúe dende o momento en que son producidas polo esgotamento das reservas endóxenas e, nalgunhas especies, polo dano producido polo desecamento e pola luz. Algunhas esporas tenden a formar agregados polo que varias delas serán contabilizadas como unha única unidade formadora de colonias (UFC). A elección do medio de cultivo pode favorecer o crecemento de determinados fungos fronte a outros que aparecerán menos representados. Os propágulos durante a mostraxe poden sufrir danos que anulan a súa capacidade de crecemento. A supervivencia das esporas unha vez liberadas é moi variable, depende das condicións ambientais, pero tamén da especie de que se trate. Mentres que algunhas esporas, como as producidas polos xéneros Aspergillus e Penicillium 219

207 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES son resistentes a condicións ambientais de sequidade, outras, como as de Botrytis o Stachybotrys chartarum, perden rapidamente a súa viabilidade, polo que van ser moito máis difíciles de detectar se utilizamos procedementos de cultivo. Así pois, o achado de S. chartarum nas mostras de bioaerosois será máis raro e, xa que logo, debe tratarse de modo diferente ao achado de especies máis comúns como as pertencentes aos xéneros Penicillium e Aspergillus. Esta infraestimación, debida á perda de viabilidade e á tendencia a formar agregados, pode superarse se, para a análise das mostras, utilizamos técnicas que non se basean no cultivo dos microorganismos: microscópicas, inmunolóxicas (ELISA) ou xenéticas (PCR). Comprobouse en diferentes traballos (Eduard et alii, 1990; Karlsson e Malmberg, 1989) que o número de microorganismos contabilizados por técnicas de cultivo é menor que o obtido por técnicas microscópicas. A distribución dos taxóns de fungos entre as mostras obtidas por impactación sobre ágar é similar á obtida mediante filtración. Medio. En xeral é esencial usar un medio que permita o crecemento de fungos xerofílicos. Se, por outra banda, a mostraxe grosa indica a presenza de especies toxixénicas S. chartarum ou a inspección visual indica crecementos sospeitosos destes fungos, debe usarse un medio que favoreza o seu crecemento. Tales medios teñen elevada actividade de auga e baixa concentración de nutrientes e deben incluír celulosa para estimular o crecemento. Variabilidade temporal. Ao valorar a variabilidade existente entre as mostras tomadas nun mesmo lugar en momentos diferentes, hai que ter especial coidado en distinguir se esa variabilidade é atribuíble realmente a unha variación na concentración do microorganismo ou se, pola contra, pode ser consecuencia da variabilidade que introduce o propio método de mostraxe e análise. A variabilidade entre mostras observouse que é maior para tempos de mostraxe máis curtos. Mesmo se sinalou que a variabilidade observada entre mostras de 1 minuto é máis de seis veces superior que a variabilidade entre mostras de 6 minutos 220

208 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES recollidas co impactador N6 de Andersen (Stanevich e Petersen, 1990). Mostradores e a súa eficiencia. Como xa vimos, os métodos básicos para a recolección de mostras de aire para determinar a presenza de microorganismos son a impactación directa sobre o medio de cultivo, a filtración a través dun filtro microporoso e o burbullo nun medio líquido. A AIHA (1996), na súa Guía de campo para a determinación de contaminantes biolóxicos en mostras ambientais, indica que, para mostrar fungos e bacterias aéreos, poden utilizarse impingers (AG-30), cyclone scrubbers, e varios tipos de impactadores: de fenda, multiperforados ou centrífugos. Malia o mostrador por impacto ser máis práctico para uso industrial ca os burbulladores, en ambientes cunha elevada presenza de bioaerosois (por exemplo, áreas agrícolas, granxas, etc.) non poden utilizarse máis que en curtos períodos de mostraxe, o que, como xa dixemos, implica un incremento da variabilidade e da imprecisión. As especies máis raras poden mesmo non aparecer representadas na mostra. En tales condicións resulta máis apropiado o emprego do burbullo en medio líquido ou da filtración, que permiten a posibilidade de realizar dilucións. Cando mostramos fungos, os problemas que se investigan son fundamentalmente de tipo alérxico ou tóxico e só en raras ocasións esperamos atopar especies infecciosas para o home. Para valorar a contaminación fúnxica é necesario determinar as especies de fungos presentes no ambiente, así como a porcentaxe relativa de cada unha das especies. Pero, ao atopar os fungos amplamente representados na natureza, é necesario establecer unha área que sirva como control (normalmente no exterior do edificio), para comparar os resultados dos dous ambientes e poder, así, determinar se a contaminación ten a súa orixe no centro onde se desenvolve a actividade ou se aquela se corresponde coa flora exterior normal. Para planificar unha mostraxe de fungos é fundamental ter un bo coñecemento sobre a súa ecoloxía, é dicir, saber en 221

209 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES que lugares crecen e baixo que condicións. Así, fungos como S. chartarum requiren un substrato de madeira mollada ou doutro material que teña base de celulosa para poder desenvolverse. Outras especies como Fusarium moniliforme só están presentes en augas estancadas. E Aspergillus versicolor pode atoparse sobre madeira ou celulosa molladas. A presenza dunhas ou doutras especies vainos orientar sobre a súa orixe (reservorios e lugares de amplificación) e sobre as medidas que hai que tomar para controlar o seu crecemento. A aparición das especies indicadas ou doutras que tamén teñen un importante poder toxixénico esixirán a toma de medidas urxentes para atallar o problema. Na valoración hixiénica dunha exposición ambiental a fungos non infecciosos teñen maior importancia o tipo de especies implicadas, e en particular o seu grao de toxicidade, que un valor absoluto de concentración ambiental expresado en UFC/m 3. MOSTRAXE DE BACTERIAS VIABLES EN AIRE As bacterias, ao igual que os fungos, tamén están presentes en todos os ambientes interiores. No aire atópanse frecuentemente especies bacterianas que non son patóxenas para o home, pero que colonizan diferentes superficies corporais formando parte da flora normal bacteriana. Estas especies poden, ocasionalmente, converterse en patóxenos oportunistas. No aire, asociadas con escamas da pel, aparecen frecuentemente especies como Staphylococcus epiderme, Micrococcus spp., e algunhas especies non patóxenas de corinebacterias e estreptococos, que se desenvolven sobre a pel. Outras especies que tamén son frecuentes nos bioaerosois habitan no chan, na auga ou nas plantas, como é o caso de Pseudomonas areuginosa (que tamén pode habitar sobre zonas húmidas da pel), Flavobacterium, Acinetobacter e Actinomycetes termofílicos. Nalgúns edificios de oficinas atopáronse elevadas concentracións de bacterias viables, da orde de UFC/m 3. En ambientes exteriores, especialmente ambientes agrícolas, son moi abundantes algunhas especies bacterianas, especialmente os actinomicetos que, xunto cos fungos das 222

210 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES especies Penicillium e Aspergillus, poden exceder as UFC/m 3. Karlsson e Malmberg (1989) atoparon, nas mostras de ambientes agrícolas, que unha media do 44% das esporas contadas por microscopía electrónica correspondían a actinomicetos. Así mesmo, estes autores sinalan que as esporas de actinomicetos teñen gran tendencia á agregación, aproximadamente tres esporas por UFC, polo que o emprego de técnicas de cultivo para o reconto vai infraestimar os niveis de exposición. Tamén debe terse en conta, ademais, que o número de bacterias viables pode representar só unha pequena porcentaxe sobre o total de bacterias presentes. Tamén nas cortes das vacas, asociadas co manexo da palla e do gran, son abundantes as bacterias mesófilas (Tª de crecemento óptimo a 30º C, as que se atopan no organismo humano entre 37º e 44º C), e, sobre todo en primavera e outono, os actinomicetos termófilos (temperatura óptima de crecemento comprendida entre 50º e 55º C, poden tolerar ata os 90º C) (Kotimaa et alii, 1991). Igualmente, as bacterias, incluídos os actinomicetos termófilos, tamén son o contaminante máis importante nos almacéns de gran, no manexo da palla e nas granxas de porcos (Edward et alii, 1990). Nas granxas de porcos e de aves, a concentración ambiental bacteriana, que pode ser superior ás 10 5 UFC/m 3 (Clarck et alii, 1983; Duchaine et alii, 2000 a), supera con moito a fúnxica. Nesta poboación bacteriana é importante a presenza de bacterias gram negativas, que representan aproximadamente o 30% e o 10% do total nas granxas de porcos e aves, respectivamente (Clarck et alii, 1983). Cormier et alii (1990), en mostras tomadas de granxas de porcos, identificaron, ademais dun bo número de bacterias gram positivas (Aerococcus spp., Bacillus spp., Micrococcus spp., Staphylococcus spp. e Streptococcus spp.), bacterias gram negativas dos xéneros Escherichia, Enterobacter, Acinetobacter, Moraxella, Pasteurella e Pseudomonas. Dende o punto de vista da hixiene industrial é fundamental distinguir entre bacterias gram positivas e gram negativas. Aínda que na análise posterior das mostras non se cheguen a identificar as especies, adoita ser necesario cuantificar 223

211 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES independentemente entre estas dúas categorías de bacterias. A diferenza fundamental entre os dous grupos de bacterias radica en que as gram negativas teñen como constituínte da membrana externa unha serie de lipopolisacáridos que funcionan como endotoxinas e que son responsables de producir enfermidades inflamatorias e de alteracións na resposta inmunolóxica a nivel pulmonar. A presenza de bacterias gram negativas e as conseguintes endotoxinas asociouse coa aparición de enfermidades como a bisinose e coa síndrome do edificio enfermo. Se o que interesa é mostrar endotoxinas, debe de terse en conta que estas poden derivar tanto de células vivas coma de células mortas, de modo que unha estimación a partir das bacterias viables vai supoñer sempre unha infraestimación do risco. A toma de mostra realízase mediante burbullo en medio líquido ou sobre un filtro e, como veremos máis adiante, a análise realízase mediante probas específicas baseadas no lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Como norma xeral, pode afirmarse que concentracións de bacterias, tanto gram positivas como gram negativas, superiores a UFC/m 3 son indicativas dunha baixa calidade do aire. Por suposto, os axentes bacterianos infecciosos necesitan dun tratamento diferenciado. Son menos comúns que os que forman parte da flora normal humana ou as bacterias ambientais, pero a súa presenza debería reducirse ao mínimo e mesmo, dependendo da súa infecciosidade e patoxenicidade, podería ser esixible a súa ausencia. Debe terse en conta que en ocasións, como é o caso de moitas bacterias causantes de enfermidades infecciosas, a mostraxe aérea de bacterias viables non resulta apropiada. Por exemplo, as bacterias Legionella spp., M. tuberculose, Bordetella pertussi ou Corinebacterium diphtheriae non sobreviven ben no aire e dánanse con facilidade durante a mostraxe, polo que a probabilidade de obter falsos negativos ou unha grave infraestimación das bacterias infectivas é moi alta. Ademais, a determinación da concentración destes 224

212 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES microorganismos no aire ten escaso valor posto que unha exposición infectiva pode producirse a partir dun pequeno número de bacterias. A infectividade está relacionada en parte coa susceptibilidade do individuo exposto polo que, xeralmente, non pode establecerse un nivel mínimo de exposición. O CULTIVO DE FUNGOS E BACTERIAS Medios de cultivo Existe unha gran variedade de medios de cultivo que poden utilizarse para mostrar bacterias e fungos ambientais polo sistema de impactación. A miúdo, nos laboratorios, realízanse pequenas modificacións sobre os medios coñecidos para mellorar as súas prestacións. O hixienista industrial, á hora de elixir os medios convenientes de mostraxe, deberá traballar de acordo co laboratorio de microbioloxía que fose elixido para a realización das análises. Os medios que existen para o illamento e cultivo de bacterias son numerosos e poden ter diversos fins. Poden estar deseñados para permitir o crecemento dun amplo rango de microorganismos (medios xerais) ou, pola contra, para favorecer só o desenvolvemento dalgúns microorganismos específicos (medios selectivos e medios enriquecidos). Existen unha serie de medios que teñen por finalidade destacar aquelas características que poden axudar a diferenciar as colonias para facilitar a súa identificación (medios diferenciais). Os medios xerais recoméndanse cando o que interesa é a carga total de bacterias en ambiente, abranguendo unha ampla variedade de microorganismos. Para a mostraxe de bacterias, como medios de tipo xeral, poden utilizarse 0'1% v/v de peptona en auga para burbulladores; e ágar de soia trypticase, ágar-sangue ou ágar nutritivo como medios sólidos para placas de impactación. A estes medios engádenselles antibióticos como a cicloheximida (500 mg/litro) para inhibir o crecemento fúnxico, e así evítase a interferencia 225

213 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES que puidese producirse sobre o crecemento bacteriano. As mostras obtidas co emprego de burbulladores, medio líquido, peptona en ágar deben sementarse despois nun medio de cultivo apropiado. Os medios selectivos son o resultado de modificacións dos medios xerais aos que se lles engaden substancias para inhibir o crecemento de certos microorganismos e favorecer o crecemento daqueles outros que consideramos de interese. Son moi útiles cando se queren detectar certos tipos de microorganismos que son difíciles de cultivar e que teñen uns requirimentos moi específicos. Así, por exemplo, Legionella spp. móstrase nun ágar BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract) ao que se lle engaden antibióticos e que se coñece como EBCYE (Environmental BCYE) e íllase en ágar BCYE con L-cisteína (AIHA, 1996). Existen moitos medios de cultivo selectivos comerciais. Os medios enriquecidos úsanse para suprimir o crecemento de microbios competitivos e aumentar o crecemento dos desexados. Se queremos illar un organismo que utiliza un determinado azucre, por exemplo, podemos preparar un medio que conteña ese azucre como única fonte de carbono. Este tipo de medios utilízanse moi raramente na mostraxe de bacterias ambientais. Os medios de illamento especializados, medios diferenciais, revelan características específicas. Conteñen nutrientes para satisfacer as necesidades específicas de certos organismos e poñen de manifesto determinadas características, morfolóxicas ou bioquímicas, das colonias que posibilitan a súa diferenciación e identificación. O ágar-sangue, por exemplo, que contén o 5% de sangue de carneiro ou de cabalo úsase para poñer de manifesto a produción de hemolisina. Tamén a adición de determinados colorantes poden servir para poñer de manifesto a utilización dun determinado azucre. 226

214 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES Cultivo de fungos En condicións óptimas, os fungos crecen moito máis lentamente que as bacterias, precisando de tempos de incubación máis longos. En especial, é necesario inhibir o crecemento bacteriano con antibióticos ou mantendo un ph ácido. O cultivo a temperaturas baixas (25º C) favorece o crecemento dos fungos fronte ás bacterias. A continuación indicamos algúns dos medios xerais máis utilizados para a mostraxe e posterior illamento e identificación de fungos, tendo sempre en conta que a elección do medio, entre os numerosos existentes, depende da intención da mostraxe e debería acordarse co laboratorio que vai procesar as devanditas mostras. Un dos medios máis amplamente utilizados na mostraxe aerobiolóxica como medio de amplo espectro, para o cultivo de fungos e fermentos é o ágar con extracto de malte. Non obstante, probáronse outros medios que parecen ofrecer resultados similares ou mesmo superiores. Morring et alii (1983) recomendan a utilización de ágar de rosa bengala con estreptomicina para a mostraxe de fungos ambientais. Estes autores sinalan como vantaxe deste medio fronte aos outros probados (ágar dextrosa de Sabouraud e ágar inhibidor de fungos) que, aínda cando todos eles ofrecen recontos equivalentes en canto ao número de colonias, a adición de rosa bengala ao medio limita o crecemento en tamaño das colonias de fungos favorecendo o seu reconto. O ágar de rosa bengala ten un inconveniente, é sensible á luz solar e debe de ser protexido cando a mostraxe se leva a cabo no exterior. Smid et alii (1989) recomendan utilizar ágar dicloran glicerol-18 (DG-18) con cloranfenicol. Este medio que foi desenvolvido inicialmente para fungos xerófilos pode tamén utilizarse como medio de amplo espectro. Restrinxe o crecemento dos xéneros que se caracterizan por un desenvolvemento rápido, como Rhizopus e Mucor, facilitando o reconto. Estes autores sinalan que o medio DG-18 ten 227

215 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES prestacións similares ao ágar con extracto de malte e ao ágar dicloran de rosa bengala e cloranfenicol. Outro medio moi utilizado para o cultivo de fungos é o ágar de Sabouraud. En principio preparouse a ph 5'6 para inhibir o crecemento bacteriano, pero, na actualidade, como o ágar de dextrosa Sabouraud de Emmons prepárase a un ph próximo ao neutro (6'5), que resulta máis favorable para o crecemento da maior parte dos fungos. A AIHA (1996) recomenda a utilización de ágar con extracto de malte como medio xeral, ao que se pode engadir rosa bengala e algún antibiótico; o emprego de ágar dicloran glicerol, DG-18, ou ágar con extracto de malte e sal (10 g NaCl por litro de auga) para os fungos xerófilos; e ágar de celulosa para a mostraxe de Stachybotrys chartarum. Non recomendan, non obstante, o emprego de medios como o ágar dextrosa de Sabouraud ou variantes do ágar de malte que conteñan importantes cantidades de glicosa, xa que os medios ricos en carbohidratos favorecen o rápido crecemento das especies e promoven o crecemento vexetativo atrasando a aparición de esporas, que son un factor importante para a identificación. Para restrinxir o crecemento dos microorganismos non desexados engádenselle antibióticos ao medio: cicloheximida (500 µg/ml), para inhibir o crecemento fúnxico, e cloranfenicol (100 µg/ml), penicilina ou estreptomicina, para inhibir o crecemento bacteriano. Hai que coidar o contido de antibióticos, pois o cloranfenicol, por exemplo, inhibe a produción de fermentos nalgúns fungos dimórficos e a penicilina e a estreptomicina poden inhibir o crecemento dalgunhas bacterias afíns aos fungos, actinomicetos, como os pertencentes aos xéneros Actinomyces e Nocardia. Como veremos máis adiante, ao presentar os exemplos seleccionados da bibliografía, os que mencionamos anteriormente son os medios máis utilizados na mostraxe de bioaerosois. Non obstante, a oferta en medios de cultivo é moi ampla, abonda consultar os catálogos de DIFCO ou BBL para darse de conta diso, e a elección dun ou doutro dependerá 228

216 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES Brancos dos obxectivos da mostraxe. Así por exemplo, podemos seleccionar ágar de ENDO, ou un medio que conteña dexosicolato de sodio, que inhibe o crecemento das bacterias gram positivas, se só nos interesa cuantificar e identificar as bacterias gram negativas. Para a mostraxe e cultivo de Legionella pode utilizarse o medio BCYE (Buffered charcoal yeast extract). En cada caso seleccionarase o máis adecuado entre os medios de cultivo dispoñibles. Os medios de cultivo han de ir acompañados de brancos. Estes brancos son necesarios por varios motivos: 1) é necesario comprobar que os medios, sobre todo aqueles que se prepararon no laboratorio, están libres de contaminación (brancos dos medios de laboratorio), para iso, antes de usar ningún lote, deben cultivarse varias das placas nas condicións previstas para as mostras de campo para comprobar a súa esterilidade; 2) é necesario asegurar que as mostras non se contaminan no proceso de manipulación ou transporte, polo que algunhas placas, brancos de campo, se manexan igual que as mostras de campo, incluíndo a etiquetaxe, a única diferenza é que sobre elas non se fai incidir aire a través do mostrador. Recoméndase a utilización de 2 brancos por cada 10 mostras, cun máximo de 10 brancos por grupo de mostras. As mostras débenlle ser entregadas ao laboratorio de análise o antes posible, preferiblemente antes de 24 horas dende a mostraxe. Aínda que o ideal sería proceder inmediatamente ao seu procesado, o máis normal é que haxa que envialas a un laboratorio que se pode atopar a moitos quilómetros. As condicións de transporte deben reducir ao mínimo os cambios que puidesen producirse na mostra captada. Deben evitarse temperaturas extremas que poden causar a morte dos microorganismos e, con carácter xeral, as mostras líquidas deben arrefriarse inmediatamente despois da mostraxe (4 ± 2 ºC). É evidente que durante o transporte se poden producir alteracións da microflora presente nas mostras. Algunhas especies sensibles ao desecamento poden morrer mentres que outras, se as condicións lles son favora- 229

217 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES bles, poden multiplicarse. En consecuencia, se non se extreman as precaucións, os resultados poderían diferir da situación real. Conservación e transporte das mostras As mostras en placas de cultivo deben incubarse inmediatamente despois de chegar ao laboratorio. Para outras mostras nas que o almacenamento sexa inevitable, este debe facerse en condicións axeitadas, por exemplo, refrixeradas, para minimizar os cambios na composición da mostra, evitando a exposición a fontes de luz visible e ultravioleta. Non obstante, hai que ter en conta as particularidades das mostras en función dos microorganismos presentes. Así, por exemplo, as mostras acuosas tomadas para a determinación de Legionella non deben refrixerarse nin almacenarse a temperaturas baixas senón a unha temperatura de 20º ± 5º C (OSHA, 1999). Deben documentarse tanto as condicións de transporte como as de almacenamento das mostras (norma UNE-EN 13098). Thorne et alii (1994) realizaron un estudo para comprobar o efecto que o transporte por correo urxente tiña sobre as mostras de campo. Para os mostradores utilizados, burbullo en medio líquido (solución de peptona e solución de betaína) e filtración, sosteñen que as mostras de bioaerosois poden ser tomadas no campo e enviadas en xeo, durante a noite, a un laboratorio distante. Non obstante, aínda respectando estas condicións, os autores observaron que as concentracións de bacterias mesófilas, na solución de peptona durante o verán, e a dos fungos, na solución de betaína, se incrementaban, mentres que a concentración de fermentos e de bacterias mesófilas diminuían significativamente cando se enviaban en filtros. Así pois, recomendan utilizar filtros cando haxa que enviar mostras nas que se queiran cuantificar fungos e organismos termófilos, e utilizar burbullador con solución de peptona cando se desexen cuantificar fermentos e bacterias mesófilas. 230

218 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES PROCEDEMENTOS PARA A IDENTIFICACIÓN E CUANTIFICACIÓN DE BIOA- EROSOIS CULTIVABLES. Aínda que non é o obxecto deste libro, imos comentar con brevidade os métodos máis comunmente utilizados para a identificación e cuantificación dos axentes biolóxicos, distinguindo entre os que se utilizan para o reconto de microorganismos cultivables, e aqueles outros que serven para identificar tanto microorganismos viables como non viables, así como os seus produtos. Ocuparémonos, en primeiro lugar, daqueles procedementos para a preparación, identificación e cuantificación de bioaerosois cultivables. Preparación das mostras As placas de ágar resultantes da mostraxe de bioaerosois téñense que incubar a unha temperatura apropiada, durante un tempo variable, en función do microorganismo de que se trate, para permitir o crecemento das colonias. Unha colonia é o resultado da multiplicación dun microorganismo, ou unha agrupación deles, ata alcanzar un nivel que o fai visible macroscopicamente. Algunhas bacterias de crecemento rápido desenvolven microcolonias no prazo dunhas horas, mentres que os fungos precisan de varios días para desenvolver colonias visibles. Mesmo algúns microorganismos precisan de tempos moi superiores. Nun cultivo de Mycobacterium tuberculose, por exemplo, haberá que esperar de 2 a 4 semanas para obter colonias visibles. No cadro que segue móstranse as temperaturas e o tempo no que, como regra xeral, se incuban as placas. 231

219 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES MICROORGANISMO TEMPERATURA TIEMPO FUNGOS 25 ºC o temperatura 3-4 días ambiente con luz natural BACTERIAS AMBIENTAIS 25 a 30 ºC BACTERIAS, ORIXE HUMANA 35 a 37 ºC comprobar as placas diariamente BACTERIA, Actinomycetes termofilos 55 a 57 ºC Os brancos de laboratorio e os brancos de campo deben manexarse do mesmo modo que as mostras. A concentración total de microorganismos cultivables obtense dividindo o número total de colonias observadas na placa entre o volume de aire mostrado. O resultado exprésase normalmente como unidades formadoras de colonias por unidade de volume de aire (UFC/m 3 ). A miúdo é difícil diferenciar varias colonias cando aquelas son o resultado do impacto de varios microorganismos sobre un mesmo lugar da placa. A ausencia de morfoloxía diferencial nas colonias ou o feito de que as substancias químicas excretadas por uns microorganismos inhiben o crecemento doutros, que se atopan no mesmo lugar, dificultan a diferenciación. Tamén pode darse o caso de que as colonias de crecemento rápido oculten os de crecemento máis lento. Para corrixir estes erros é necesario un axuste estatístico a partir do número de colonias observado, como se expuxo ao tratar os impactadores. A norma UNE-EN recomenda, para evitar unha perda da exactitude do reconto debido ao crecemento incontrolado dos microorganismos, que durante o período de incubación se observen as colonias regularmente e se rexistren a medida que se formen. Identificación de bioaerosois cultivables. Para a clasificación e identificación dos microorganismos cultivables é moi común utilizar técnicas de microbioloxía clásica, baseadas na observación das características macroscópicas da colonia na placa de cultivo (forma, cor, textura, etc.) e das características microscópicas do microorganismo 232

220 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES (forma, tamaño, presenza de determinadas estruturas, mobilidade, etc.). Ademais, estas técnicas de microbioloxía clásica utilizan para a identificación dos microorganismos unha serie de probas que poñen de manifesto determinados aspectos bioquímicos e fisiolóxicos do microorganismo: constituíntes da parede celular, encimas que posúe, rango óptimo de temperatura de crecemento, dependencia de osíxeno, substratos nutritivos utilizados, fonte de carbono, fonte de nitróxeno, e produtos de fermentación e modos de metabolismo (autotrofo, heterotrofo, fermentativo ou respiratorio). Pero, xunto a estes métodos, existen outros que son utilizados tanto para a identificación dos microorganismos cultivables como non cultivables, moito máis específicos e sensibles que se basean en reaccións antíxeno-anticorpo ou na detección de fragmentos de ADN. Microbioloxía clásica A microbioloxía clásica inclúe métodos xerais para a clasificación e identificación de microorganismos. Estes métodos son pouco específicos, pois baséanse na observación das características de crecemento, aparencia do microorganismo en medio líquido, morfoloxía da colonia en medio sólido e a pigmentación, que poden ser comúns a un gran número de especies. No ámbito celular, nas bacterias, ponse atención a aspectos morfolóxicos: forma da célula, tamaño, tipo de agrupacións celulares que forman, presenza ou ausencia de flaxelos e a súa localización na célula, presenza de pili, existencia de cápsula ou formación de endosporas. O conxunto destas características, unido ao emprego de tinguiduras simples e diferenciais, poden axudar a identificar o microorganismo ou, polo menos, a encadralo dentro dun grupo. A tinguidura simple é un método de tinguidura de microorganismos cunha tinguidura básica simple que, na súa posterior observación microscópica, realza as características antes mencionadas. Para a observación e reconto de bacterias utilízanse tinguiduras como azul de metileno, carbolfucsina, cristal violeta ou safranina. 233

221 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES Hai outro tipo de tinguiduras, as tinguiduras diferenciais que, baseándose en diferentes reaccións, distinguen entre estruturas ou microorganismos. Un exemplo de tinguidura diferencial amplamente utilizada é a tinguidura gram. A tinguidura gram permite diferenciar entre dous grandes grupos de bacterias: as gram positivas, que se ven de cor azul, e as gram negativas, de cor vermella. O mecanismo da tinguidura gram explícase baseándose nas diferenzas da parede celular dos dous grupos bacterianos. As bacterias gram positivas posúen unha parede celular composta dunha capa relativamente grosa de peptidoglucano e ácidos teicoicos, mentres que carecen de fosfolípidos. As bacterias gram negativas teñen unha parede celular composta dunha capa fina de peptidoglucano e unha membrana exterior formada por lipoproteínas, lipopolisacáridos e fosfolípidos. Esta clasificación é interesante dende o punto de vista hixiénico porque moitos destes lipopolisacáridos que as bacterias gram negativas posúen na súa membrana exterior son endotoxinas. O proceso de tinguidura gram é o seguinte: 1. Colócase sobre o portaobxectos a disolución de bacterias e esténdese. 2. Déixase secar ao aire e fíxase quentando (60º C) o portaobxectos con lapas. 3. Tínguese co colorante de cristal de violeta durante 90 segundos. 4. Lávase con auga destilada. 5. Tínguese con lugol durante 2 minutos. 6. Lávase con etanol e, posteriormente, con auga destilada para lavar o alcol. 7. Tínguese con safranina durante 2 minutos. 8. Lávase con auga corrente, sécase e obsérvase co microscopio. Todas as bacterias permiten o paso do cristal violeta, que as tingue de azul. Pero as bacterias gram positivas forman xunto ao lugol un esmalte impermeable ao alcohol, polo que este grupo manterá a cor azul, xa que o etanol non pode entrar a lavalo. As bacterias gram negativas son decoloradas 234

222 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES polo etanol e, máis tarde, quedan tinguidas de vermello pola safranina. Algunhas especies de bacterias, en particular do xénero Mycobacterium non se tinguen facilmente. Para a identificación preliminar das distintas especies poden utilizarse diversos medios que revelan unha serie de características diferenciais. Así, para o caso dos bacilos entéricos, o ágar triplo azucre ferro (TSI), que contén lactosa, glicosa, sacarosa e sulfato ferroso amónico, entre outros produtos, permiten detectar nun só cultivo a fermentación dos tres azucres, ademais da produción de H 2 S e da produción de gas. Non obstante, a metodoloxía convencional require a confirmación das fermentacións observadas en medios líquidos axeitados que conteñan como fonte de carbono só un dos azucres. Para simplificar este laborioso traballo existen na actualidade sistemas miniaturizados, como veremos máis adiante. En xeral, os fungos clasifícanse pola morfoloxía das esporas, pola súa forma de produción e pola morfoloxía das colonias. A observación microscópica pode facerse directamente sobre as colonias, ou sobre fragmentos destas, debidamente tinguidos. Pódense realizar tinguiduras como as de azul algodón de lactofenol (azul de Poirrier) ou do ácido periódico-schiff (coloración PAS). O quentamento da mostra cun 10% de KOH ou NaOH facilita a visualización da parede celular. Non obstante, co só emprego destas técnicas, é difícil a identificación dos fungos. Os fungos son gram positivos. Microbioloxía clínica. Actualmente, para a identificación de bacterias, existen baterías de probas comerciais que inclúen características bioquímicas, fisiolóxicas e nutricionais. Estas baterías baséanse na estandarización das probas convencionais utilizadas para poñer de manifesto determinadas características bioquímicas. Ao igual que as probas de microbioloxía clásica, requírese o cultivo dos microorganismos para obter a colonia obxecto de estudo, pero necesitan menos cantidade de material e os resultados obtéñense antes. Algunhas 235

223 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES destas probas comerciais para a identificación de bacterias requiren unha investigación previa con tinguidura gram. Algúns dos lotes de identificación comerciais dispoñibles son (NIOSH, 1998): API 20 E (Analytab Products, Plainview, NY); Enterotube II and R/B Enteric (Roche Diagnostics Systems, Nutley, NJ; Hoffmann-A Roche & Co., AG, Basel, Switzerland); Micro-IDE (Organon Teknika- Cappel, Durham, NC); Minitek and Sceptor (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD); e MicroScan (American Microscan, Inc., Sacramento, CA). O API 20 E, por exemplo, é un sistema para a identificación de Enterobacteriaceae e outros bacilos gram negativos, mediante 23 test bioquímicos. A galería API 20 E consta de 20 microtubos que conteñen os substratos deshidratados. Os test inocúlanse cunha suspensión bacteriana que rehidrata os medios. Durante a incubación, espontaneamente ou ao engadir reactivos, o metabolismo da bacteria produce cambios de cor. As probas que inclúe o test poñen de manifesto a presenza de encimas que se detectan pola utilización de determinados substratos (ß-galactosidasa, arxinina dehidrolasa, lisina descarboxilasa, ornitina descarboxilasa, etc.), os produtos metabólicos (H 2 S, indol, acetoína, NO 2 N 2, N 2 ), o tipo de metabolismo (fermentativo ou oxidativo) fronte a determinados azucres (glicosa, manitol, sacarosa, arabinosa, etc.), a mobilidade ou o crecemento sobre medios específicos (MacConkey). Logo da valoración obtense un perfil numérico (7 ou 9 números, segundo o número de probas necesario) que pode buscarse na base de datos e que nos permite asignar, cunha probabilidade determinada, unha especie. Outro sistema de identificación é o que se basea na análise de ácidos graxos celulares. O perfil dos ácidos graxos celulares que se localizan na membrana e na parede celular das bacterias, cando crecen baixo condicións estandarizadas, é reproducible cun xénero, unha subespecie ou a nivel de cepa nalgúns microorganismos. O sistema de identificación microbiana (Microbial Identification System; MIS), desenvolvido por MIDI (Newark, DE) proporciona unha 236

224 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES técnica cromatográfica e unha biblioteca de software capaz de identificar varios microorganismos baseándose na súa composición de ácidos graxos celulares. Actualmente, MIDI está a distribuír un método prototipo para extraer e analizar fungos. PROCEDEMENTOS ADICIONAIS PARA A IDENTIFICACIÓN E CUANTIFICACIÓN TANTO PARA BIOAEROSOIS VIABLES E NON VIABLES. Microscopía A clasificación dos microorganismos non viables ou viables, pero non cultivables, non se pode realizar usando os métodos descritos na sección precedente, xa que estes precisan dunha colonia de microorganismo sobre a que traballar. A identificación deste tipo de microorganismos, debido ao escaso número de exemplares dispoñibles, require o uso de técnicas dunha maior sensibilidade que permita detectar cantidades mínimas do axente ou dos seus produtos. As técnicas englóbanse en dous grupos: as microscópicas e as de bioloxía molecular. As técnicas microscópicas poden usarse, ademais de para a identificación, para o reconto de microorganismos. Microscopía óptica. Na microscopía óptica utilízase un microscopio ordinario. A fonte de iluminación utilizada entra dentro do rango da luz visible e o obxecto aparece sobre ese fondo brillante. O seu poder de resolución é moi limitado (0'2 µm) polo que ofrece escasos detalles das células microbianas. Non obstante, o axente pode ser clasificado a partir do seu tamaño, a súa forma externa (coco, bacilos, espirilos...), os tipos de agrupacións a que dá lugar (diplococos, estreptococos, estafilococos, sarcinas) e as súas propiedades de coloración. Este método úsase normalmente para o reconto de microorganismos e, xunto coa microscopía electrónica, adoita ser o método elixido para identificar e contar as esporas de fungos. A norma UNE-EN recomenda, para mostras que foron recollidas sobre un filtro ou nun medio líquido, que o reconto de microorganismos se leve a cabo sobre, polo 237

225 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES menos, 50 campos que poden escollerse aleatoriamente ou distribuídos regularmente sobre o filtro ou ben que se conten 400 microorganismos. Os microorganismos deben contarse utilizando unha retícula de ocular calibrada. Microscopía de contraste de fases A microscopía de contraste de fases úsase cando o organismo baixo observación, debido ao seu pequeno tamaño, é practicamente invisible á microscopía óptica. O microscopio de contraste de fases usa un condensador especial e unha placa para difractar os raios de luz de modo que os microorganismos aparecen con diferentes graos de brillantez e contraste. Este tipo de microscopio úsase para a observación detallada das estruturas internas dos organismos vivos. Non require tinguidura. Microscopía de fluorescencia A microscopía de fluorescencia utiliza unha fonte de iluminación de raios ultravioleta ou próximos aos ultravioletas, responsable de que os compoñentes fluorescentes do axente biolóxico emitan luz. Para incrementar esta fluorescencia poden empregarse colorantes como a laranxa de acridina. A microscopía de fluorescencia utilizouse para o reconto directo de microorganismos sobre filtros, con bos resultados, sobre todo cando aqueles representan só unha pequena proporción das partículas que se atopan sobre o filtro, ou cando eles mesmos se atopan adheridos a outras partículas, grazas á especificidade do colorante polos microorganismos (Eduard et alii, 1990). Microscopía electrónica A microscopía electrónica utiliza un feixe de electróns en vez de luz. Como consecuencia da máis baixa lonxitude de onda dos electróns, o seu poder de resolución é maior (próximo a 1 μm) e permite visualizar estruturas inferiores a 0'2 mm. A microscopía electrónica de varrido ofrece imaxes en tres dimensións, polo que se usa para estudar as características superficiais de células e microorganismos, aumentadas 238

226 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES de a veces. Permite observar un maior número de detalles da estrutura dos axentes biolóxicos, que poden axudar á súa clasificación. Karlsson e Malmberg (1989) consideran que esta técnica é adecuada para a avaliación total da exposición a esporas de actinomicetos e fungos, que se distinguen pola súa aparencia morfolóxica; para realizar medidas do tamaño e da tendencia á agregación dos microorganismos e para clasificalos, polo menos, de forma parcial. Pola súa banda, para observar seccións finas de células ou virus, utilízase a microscopía electrónica de transmisión. Esta técnica ofrece unha imaxe en dúas dimensións pero cun gran poder de resolución, con aumentos comprendidos entre as e veces. A microscopía electrónica non permite distinguir os microorganismos viables dos non viables. Inmunoensaios O inmunoensaio é unha técnica analítica que se basea nunha reacción de especificidade entre a molécula cuxa presenza queremos determinar, o antíxeno, xeralmente proteínas ou polisacáridos da superficie dos microorganismos, e un anticorpo que se une a el. Para poder realizar o diagnóstico por inmunoensaio é necesario, pois, que dispoñamos do anticorpo específico. A unión entre o anticorpo e o antíxeno diana forma a base do inmunoensaio, pero, ademais, é necesario dispoñer de mecanismos que fagan visible e cuantificable a devandita reacción. As distintas técnicas de inmunoensaio diferéncianse polo sistema utilizado para marcar o anticorpo (encimas, indicadores radiactivos ou moléculas fluorescentes). Este tipo de análise é moi sensible e pode realizarse sobre unha matriz complexa sen necesidade de que a mostra estea moi limpa. Na actualidade, existen numerosos test de inmunoensaio comerciais. Os métodos de inmunodiagnóstico máis utilizados son: Radioinmunoensaio Unha determinada cantidade de antíxenos radiomarcados engádense conxuntamente con diferentes concentracións de antíxenos non marcados a tubos de test que conteñen o 239

227 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES anticorpo específico. Os antíxenos non marcados compiten cos antíxenos marcados para unirse aos anticorpos, de modo que, canto maior sexa a concentración de antíxenos non marcados na mostra, menor será a cantidade de complexos antíxeno-anticorpo marcados formados. Os antíxenos non unidos retíranse antes de determinar a cantidade formada de antíxeno-anticorpo radiomarcados. Entón constrúese unha curva patrón que mostra o efecto dunha cantidade coñecida de antíxeno non marcado sobre a cantidade de antíxeno-anticorpo marcado formada. Por comparación con esta curva, é posible determinar a cantidade dun antíxeno non marcado, neste caso descoñecido, presente nunha mostra determinada. Un método alternativo a este baséase no emprego de anticorpos radiomarcados. Inmunoensaios de fluorescencia Esta técnica baséase na utilización de anticorpos marcados con moléculas fluorescentes (por exemplo, o isotiocianato de fluoresceína) para detectar antíxenos bacterianos. Os anticorpos aos que se uniron unha ou varias destas moléculas son intensamente fluorescentes, sen que se vexa afectada a súa reactividade específica. Os anticorpos marcados poden usarse en secuencias de reaccións tanto directas (o anticorpo marcado reacciona directamente co antíxeno que está unido á célula) como indirectas (o anticorpo específico contra o antíxeno non está marcado, os anticorpos marcados son específicos contra as inmunoglobulinas). Inmunoensaios encimáticos Estes ensaios baséanse no uso de complexos encima-anticorpo unidos covalente. Os encimas utilizados (por exemplo, peroxidasa, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa) proporcionan produtos doadamente medibles. A actividade encimática, ante a presenza dun cromóxeno, dá como resultado un produto final coloreado. A cuantificación lévase a cabo usando un espectrofotómetro para medir a intensidade da cor. A maioría dos inmunoensaios encimáticos dispoñibles comercialmente son ensaios inmunoadsorbentes ligados a encima (ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay). Este é un 240

228 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES inmunoensaio competitivo no que o anticorpo específico, que non está marcado, reviste as paredes do tubo de test. Ao engadir as mostras que conteñen o antíxeno e os antíxenos ligados ao encima, prodúcese un cambio de cor que se relaciona coa cantidade de antíxeno presente na mostra. Os test ELISA poden ser cualitativos e cuantitativos. Para cuantificar xérase unha curva patrón a partir de concentracións de antíxeno coñecidas. Tamén se empregan para analizar produtos derivados dos microorganismos, como por exemplo, as aflatoxinas (Autrup et alii, 1991), sempre que sexa posible obter anticorpos específicos. Actualmente, os ensaios ELISA están moi automatizados e os esforzos diríxense a desenvolver lotes comerciais ben estandarizados que conteñan controis e materiais apropiados. Probas xenéticas A aplicación das técnicas de bioloxía molecular aos métodos de diagnóstico de bacterioloxía, viroloxía e micoloxía permitiu desenvolver probas altamente específicas e sensibles. Algunhas das probas xenéticas máis utilizadas son: Probas de ADN oligomérico sintético Deséñase e sintetízase quimicamente un curto segmento de ADN de cadea sinxela, xeralmente de bases de lonxitude. Cando se coñece a secuencia precisa de ADN do organismo diana, deséñase unha sonda complementaria que representa unha parella perfecta do ADN diana. Non obstante, cando non se coñece a secuencia precisa non se pode deseñar unha única sonda que manifeste unha complementariedade exacta, aínda que, aproveitando os coñecementos que actualmente temos sobre o código xenético e o uso de codóns, poden obterse sondas que mostren un grao de emparellamento, senón perfecto, si elevado. Como alternativa poden sintetizarse un grupo ou familia de sondas que cubran todas as secuencias posibles de ADN no organismo diana. Para que as sondas, logo dos experimentos de hibridación, poidan ser detectadas, deben ir marcadas. Xeralmente emprégase o fósforo 32 ( 32 P) como marcador. 241

229 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES Reacción en cadea da Polimerasa (PCR, Polymerase chain reaction) A reacción en cadea da polimerasa revolucionou o mundo do diagnóstico mediante a análise de ADN. Este método baséase na amplificación (a síntese encimática in vitro de miles de copias) dun ADN diana. Para iso tómanse dous segmentos de ADN de cadea simple sintéticos, xeralmente de bases de lonxitude, que serven de iniciadores para a replicación (primers) e que se unen ao ADN diana, permitindo unha rápida amplificación encimática do ADN complementario. O método é extremadamente sensible e específico e non fai necesario o cultivo do organismo. Análise polimórfico de tramos de fragmentos de restrición Esta técnica utilízase para distinguir cambios xenéticos dentro das especies. Mediante técnicas de cultivo obtense un clon puro de cada un dos organismos de interese. A partir deste clon íllase o ADN xenómico e córtase cunha serie de encimas de restrición, xerando fragmentos de ADN de varios tamaños. Mediante unha electroforese sobre xel obtense unha distribución dos fragmentos de ADN en función do seu talle. Esta distribución de fragmentos pode compararse con outros illados, de modo que, se aparecen fragmentos con tamaño diferente, pode pensarse que se trata de clons distintos. Ensaio de endotoxina A endotoxina é un lipopolisacárido que forma parte da membrana externa da parede celular das bacterias gram negativas. Como xa vimos, é un importante factor de virulencia que pode causarlles problemas de saúde ás persoas expostas. A súa determinación realízase a través dun test baseado no lisado dos amebocitos que se atopan na linfa do cangrexo de ferradura, Limulus polyphemus. Se expoñemos as células de amebocitos lisadas a unha suspensión de líquidos que contén niveis de picogramo de lipopolisacárido (endotoxinas), actívase o sistema de coagulación da linfa do cangrexo e prodúcese unha xelificación. Este test chámase o 242

230 MOSTRAXE DE FUNGOS E BACTERIAS VIABLES ensaio do lisado de amebocitos de Limulus. A cuantificación realízase por comparación cunha curva de calibración realizada a partir dun patrón de endotoxina de referencia. O resultado exprésase como unidades de endotoxina (UE)/ml. Os laboratorios de microbioloxía clínica usan esta proba como test para determinar a existencia de contaminación producida por bacterias gram negativas. As medidas realizadas polos distintos laboratorios non son directamente comparables entre si, xa que, como demostraron Olenchock et alii (1989), a utilización de diferentes métodos de mostraxe, e de distintas solucións e tempos de extracción, dan lugar a importantes diferenzas. As mostras para a análise de endotoxinas deben almacenarse a unha temperatura inferior a -20º C (norma UNE-EN 13098). Recentemente foi aprobada a norma UNE-EN sobre Atmoferas no lugar de traballo. Determinación de endotoxinas en suspensión no aire, que debe contribuír a unificar os criterios de actuación no que se refire á mostraxe e análise de endotoxinas. 243

231 CRITERIOS DE VALORACIÓN

232 CRITERIOS DE VALORACIÓN Unha vez que se mediron os niveis de exposición, a valoración realízase normalmente por comparación con criterios de referencia, os denominados criterios de valoración (por exemplo, para o caso dos contaminantes químicos, os valores límite ambientais, VLA, e valores límite biolóxicos, VLB, do INSHT; ou os Threshold Limit Values, TLV, e Biological Exposure Indices, BEIs da ACGIH). O criterio de valoración establécese a partir dos resultados obtidos de estudos que relacionan os niveis de exposición cos efectos producidos. O seu valor establécese en función dun efecto máximo tolerable. Normalmente exprésanse como concentracións, cantidades ou enerxías máximas permisibles de contaminantes. A valoración da exposición en relación con estes criterios permite estimar o risco que para a saúde do traballador representa a devandita exposición. No caso dos axentes biolóxicos, o nivel máximo tolerable sería aquel a partir do cal se manifestan os efectos tóxicos ou alérxicos ou se produce a enfermidade. Non obstante, non existen suficientes estudos que relacionen os niveis de exposición cos efectos producidos e non se estableceron, polo menos para a maioría dos axentes, límites de exposición permisibles. Mesmo en ocasións, como acontece coas enfermidades oportunistas, para que se produza a enfermidade é máis importante o estado fisiolóxico e de saúde do traballador que os niveis de exposición. Mentres que unha persoa nun estado inmunolóxico normal non se verá afectada pola presenza de millóns de Aspergillus fumigatus, para un individuo deficiente inmunoloxicamente, unha simple espora podería ser suficiente para producir enfermidade. Os axentes biolóxicos, infecciosos ou non, e os materiais derivados deles (toxinas, antíxenos, etc.) non poden tratarse de igual modo que os axentes físicos ou químicos, pois entre eles existen diferenzas substanciais que veremos a continuación. Estas diferenzas van determinar o modo de afrontar a valoración dos riscos. As características típicas dos materiais biolóxicos son as seguintes (Lee e Johnson, 1997): 247

233 CRITERIOS DE VALORACIÓN Non existen límites biolóxicos de exposición. Un organismo patóxeno é capaz de replicarse e, nalgúns casos, se se dan as condicións precisas, de infectar un hospedador e causar unha enfermidade. Non existen datos precisos, para a maioría dos axentes biolóxicos, sobre o número de microorganismos que poden dar lugar a unha infección. Ademais este número pode variar dun individuo a outro. Son ubicuos no medio. O concepto de límite de exposición permisible para axentes biolóxicos non é apropiado, xa que os axentes biolóxicos se atopan comunmente no ambiente e non son, necesariamente, o resultado dunha determinada actividade laboral. Os axentes biolóxicos poden adaptarse ás condicións ambientais e unha mostra diso é, por exemplo, a adquisición de resistencia aos antibióticos. A concentración non é o único factor que os fai daniños. Os seus efectos patóxenos dependen dunha multitude de factores. Os axentes biolóxicos vense afectados pola competencia biolóxica. Os efectos que producen non son sinérxicos no sentido en que poden selo os efectos dunha exposición a mesturas de axentes químicos. Os axentes biolóxicos compiten entre eles para dominar o ambiente e despois de entrar no hospedador poden ser inactivados polo sistema inmune ou por outros procesos metabólicos. No caso de individuos inmunodeprimidos, as defensas do hospedador son menos efectivas, e os axentes que non son patóxenos para individuos sans poden causarlles infección, enfermidade, e mesmo a morte. Para avaliar o risco, o hixienista debe coñecer e considerar a natureza do organismo e os seus produtos, a natureza do hospedador (fisioloxía humana e resposta inmunitaria) e as condicións ambientais. A percepción do risco non é un criterio obxectivo, senón que pode verse modificado por factores externos, positiva ou negativamente. Factores como o grao de adestramento para realizar unha determinada actividade, a motivación do traballador para seguir as precaucións establecidas, a utilización de roupa de protección per- 248

234 CRITERIOS DE VALORACIÓN soal, informar correctamente o traballador sobre os riscos e as medidas preventivas existentes para previlos, etc., poden modificar a percepción do risco. A valoración dos resultados obtidos tras unha mostraxe de contaminantes biolóxicos non é doada. As mostras ambientais poden conter microorganismos de diferentes características (cultivables, viables pero non cultivables ou non viables), fragmentos destes microorganismos ou produtos do seu metabolismo que poden ter efectos tóxicos ou alérxicos. Os resultados da mostraxe pode darse como concentración ambiental UFC/m3 ou, simplemente, como presenza ou ausencia dun determinado axente, que en determinados casos (axentes altamente patóxenos, cuxa presenza é inadmisible, comprobación da efectividade das medidas de contención) pode ser suficiente. A valoración é diferente en función de que se trate de axentes capaces de producir unha enfermidade infecciosa ou de axentes que ocasionan respostas alérxicas ou tóxicas. No primeiro caso é fundamental establecer a patoxenicidade do axente, a súa virulencia, a súa transmisibilidade e se existe ou non tratamento eficaz e/ou vacina. Sobre estes aspectos infórmanos o anexo II do Real decreto 664/1997, sobre a protección dos traballadores contra os riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos durante o traballo, que clasifica os axentes biolóxicos en catro grupos en función das características mencionadas. Aqueles axentes que non aparecen no devandito anexo han de clasificarse tendo en conta as definicións dadas para cada grupo no artigo 3 do mencionado real decreto. Ademais, no seu artigo 4, este real decreto esixe: identificados un ou máis riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos durante o traballo, procederase, para aqueles que non puidesen evitarse, a avalialos determinando a natureza, o grao e a duración da exposición dos traballadores. Os dous factores que determinan a valoración do risco, como mencionamos no capítulo dedicado á avaliación de riscos, son a probabilidade de que suceda o dano e as consecuencias que leva consigo ese dano (severidade). A severidade 249

235 CRITERIOS DE VALORACIÓN vai depender do axente implicado, é dicir, da súa virulencia, pero tamén de factores individuais como a resistencia do traballador ou a súa inmunización previa, etc. Tamén a probabilidade de que se produza o dano vai depender de numerosos factores. Lee e Johnson (1997) sinalan que para que se produza unha infección han de cumprirse todos e cada un dos elos da que eles denominan cadea da infección (figura 13): 1) patoxenicidade do axente biolóxico; 2) existencia dun reservorio; 3) liberación ao medio dende ese reservorio; 4) transmisión a través do medio; 5) existencia dun portal de entrada; 6) susceptibilidade do hospedador. Así pois, a valoración e, como veremos máis adiante, as medidas de control han de ter en conta a existencia destes elos. No caso da valoración do risco habería que ter en conta cada un destes aspectos individualmente xa que, se nalgún deles rompe, a cadea a infección non é posible. Cando se trate de traballos que impliquen a exposición a varias categorías de axentes biolóxicos, os risco avaliaranse baseándose no perigo que supoñan todos os axentes biolóxicos presentes. A natureza do axente biolóxico vainos dar unha idea do risco que supón para o traballador: a gravidade da enfermidade que pode ocasionar, o tipo de tratamento que existe e o grao de infectividade. Terase en conta a información existente sobre as enfermidades susceptibles de ser contraídas polos traballadores como resultado da súa actividade profesional e as recomendacións das autoridades sanitarias para controlar os axentes biolóxicos. Cómpre considerar, ademais, a posibilidade de potenciais efectos tanto alérxicos como tóxicos, que poidan derivarse da exposición aos devanditos axentes. Por último, ha de valorarse o risco adicional para aqueles traballadores especialmente sensibles en función das súas características persoais ou estado biolóxico coñecido, debido a circunstancias tales como patoloxías previas, medicación, trastornos inmunitarios, embarazo ou lactación. Os axentes biolóxicos non infecciosos e os produtos derivados dos axentes biolóxicos poden producir enfermidades 250

236 CRITERIOS DE VALORACIÓN tóxicas ou alérxicas (alveolite alérxica, asma, rinite alérxica, conxuntivite) e han de tratarse de modo distinto os axentes infecciosos. Malia ser certo que hai determinadas especies que pola súa especial toxicidade, como é o caso dos fungos produtores de micotoxinas (Aspergillus, Cephalosporium, Fusarium, Penicillium, Trichoderma, Stachybotrys), deben valorarse independentemente, a maioría destes axentes valóranse conxuntamente como produtores de endotoxinas, no caso das bacterias, de (1-3)-ß-D-glucano ou de alérxenos. Non se pode esquecer que algúns destes axentes non infecciosos baixo determinadas circunstancias (individuos inmunodeficientes) poden chegar a producir enfermidades infecciosas. Eduard e Heederik (1998) son da opinión de que os efectos sobre a saúde debidos á exposición a axentes non infecciosos depende non só da súa concentración no aire, senón tamén das especies, tamaño e condicións de viabilidade e crecemento. Os límites de exposición deberían desenvolverse non para niveis totais de microorganismos, senón para especies ou grupos de microorganismos como bacterias gram negativas, actinomicetos, esporas de fungos e substancias tóxicas de orixe microbiana como endotoxinas e alérxenos. A primeira dificultade para valorar os axentes biolóxicos estriba en coñecer con precisión o tipo e a concentración de microorganismos ambientais. Os axentes biolóxicos menos representados poden escapar á mostraxe xeral e outros poden sufrir danos que afectan a súa viabilidade, co que é moi probable que obteñamos falsos negativos ou importantes infraestimacións de determinadas especies. Así mesmo, durante o envío das mostras ao laboratorio, a composición das mostras pode verse afectada. Debemos, pois, coñecer as limitacións que presenta o procedemento utilizado, incluíndo os métodos de mostraxe e analítico, para corrixir os seus efectos. Os microorganismos, como seres vivos que son, poden reproducirse. A súa supervivencia, reprodución e dispersión van depender das condicións ambientais. Por iso, o seu coñecemento é esencial á hora de descartar a presenza de determinados organismos, á vez que nos permite supoñer a 251

237 CRITERIOS DE VALORACIÓN presenza doutros. Por exemplo, en ambientes húmidos e fríos espera un desenvolvemento maior de fungos. Se existen materiais húmidos que conteñen celulosa é moi probable a presenza de S. chartarum. Nos lugares de traballo os microorganismos poden proceder do ambiente exterior ou, pola contra, poden provir de lugares situados no interior do local que funcionan como reservorios ou como sitios de amplificación. Evidentemente, a interpretación non pode ser a mesma nun ou noutro caso, de aí a necesidade de mostrar no interior e no exterior do local de traballo, e comparar a contaminación estimada en cada un deles, tendo en conta tanto as especies presentes como a importancia relativa de cada unha delas. Ante a falta duns límites máximos de exposición precisos, na valoración hixiénica dos axentes biolóxicos non infecciosos cobra unha importancia fundamental a comparación entre as especies que aparecen no local de traballo e as que aparecen noutras áreas tomadas como control, normalmente o ambiente exterior ou outra zona do edificio sen problemas. Estas comparacións son máis significativas no caso dos fungos que no das bacterias. As especies de fungos no interior, en ausencia de focos contaminantes, non deben ser significativamente diferentes das que aparecen no exterior, tanto en tipo coma en frecuencias. Cando as diferenzas entre os dous ambientes son obvias, pode ser suficiente con realizar unha comparación informal. Pero, cando as diferenzas non son tan claras, hai que recorrer a unha aproximación estatística. Con este obxectivo, un dos estatísticos máis utilizados é o de coeficientes de correlación por rangos ordenados de Spearman. Este estatístico, recomendado pola American Industial Hygiene Association (AIHA, 1996), é doado de aplicar para comparar grupos de datos que non se distribúen normalmente. Sen afondar nos seus fundamentos, diremos, unicamente, que se basea en comparar a orde que, en función da súa frecuencia de aparición, ocupan as diferentes especies en cada un dos ambientes. 252

238 CRITERIOS DE VALORACIÓN As conclusións obtidas pola aplicación deste estatístico deben tomarse con precaución pois, xeralmente, o número de mostras recollidas nos dous ambientes non adoita ser suficiente para garantir a validez da súa aplicación dada a elevada fluctuación nas concentracións de bioaerosois en períodos de tempo relativamente breves (Spicer e Gangloff, 2000). Estes problemas poden minimizarse aumentando o número de mostras recollidas, tendo en conta, ademais, que o número de mostras tomadas na zona de control debe ser, polo menos, tan grande como o número de mostras tomadas na área obxecto de estudo. En todo caso, o test de coeficientes de correlación por rangos ordenados de Spearman non pode usarse cando o número de especies presentes nas mostras sexa inferior a seis. As concentracións ambientais dos axentes biolóxicos varían enormemente co tempo. Se encima, como acontece en numerosas ocasións, nos vemos obrigados a realizar mostraxes curtas, a variabilidade entre mostras é importante. A mostraxe debe de cubrir estas posibilidades para reflectir o máis fielmente posible a situación real en cada momento. Existen prácticas que incrementan a aerosolización e diseminación dos axentes biolóxicos. Deben terse en conta aspectos como o funcionamento de máquinas, movemento das persoas, realización de operacións de limpeza, etc., pois calquera modificación pode supoñer unha variación substancial do resultado final. Para contrarrestar esta enorme variabilidade, recoméndase tomar varias mostras nun mesmo punto, ademais de brancos para asegurar a esterilidade do medio. Así mesmo, para cubrir un maior rango de bioaerosois recórrese a miúdo á utilización de varios métodos de mostraxe e de diversas técnicas analíticas. Pero, aínda supoñendo que conseguísemos minorar e valorar os efectos producidos polos factores antes indicados, seguiremos tendo o problema de que non existen relacións dose-resposta para a maioría dos axentes biolóxicos causantes de enfermidades en humanos. Os bioaerosois son mesturas complexas e os efectos que producen non se 253

239 CRITERIOS DE VALORACIÓN deben normalmente a un só tipo de organismo, senón á interacción (positiva ou negativa) entre todos os que están presentes. Ademais, como xa se sinalou en diversas ocasións, a resposta do traballador vai depender de factores como o estado inmunolóxico, estado fisiolóxico ou a existencia de prácticas que coadxuvan ao desenvolvemento da enfermidade. Vexamos entón como se pode valorar a presenza dun número determinado de microorganismos. A valoración implica aspectos persoais, sociais, económicos e científicos. En ausencia de criterios numéricos de valoración, é necesario decidir con antelación os criterios de interpretación que serán utilizadas para determinar se un ambiente está ou non contaminado. En termos xerais, pódense considerar os seguintes criterios de interpretación dos resultados obtidos (Hernández, 1996): Os tipos e frecuencias relativas dos contaminantes biolóxicos no ambiente con problemas e nun ambiente control (o exterior ou outro local sen problemas). A evidencia médica de que unha infección ou alerxia foi causada por un contaminante biolóxico específico. As relacións existentes entre o ambiente interior e o ambiente control que poden indicar posibles amplificacións. A avaliación dos reservorios e as posibilidades de amplificación e de diseminación. VIRUS Nesta nota técnica danse unhas pautas que poden axudar a interpretar os resultados obtidos na mostraxe de bioaerosois. Moitas enfermidades asociadas aos virus presentan síntomas ben definidos, polo que a existencia dunha enfermidade é a demostración de que o virus estivo presente. 254

240 CRITERIOS DE VALORACIÓN BACTERIAS Non se coñece o número de partículas necesarias para causar unha infección nun individuo susceptible, aínda que existen evidencias que suxiren que un único virus pode ser capaz de iniciar a infección. Polo momento non existen probas de que a exposición a virus poida causar intoxicacións ou sensibilizacións. Os virus son parasitos intracelulares obrigados e, polo tanto, son as persoas as que actúan como amplificadores. Na diseminación poden intervir vectores artrópodos, como por exemplo, nos arbovirus. A transmisión prodúcese normalmente de persoa a persoa polo que a valoración ambiental é menos necesaria. O control dos virus baséase en evitar que o axente pase da persoa enferma ou portadora á sa. Factores tales como o aumento da ocupación ou unha escasa renovación do aire poden contribuír ao aumento da taxa de contaxio. As bacterias colonizan numerosos ambientes. Moitas delas, mesmo as que producen enfermidades infecciosas en humanos, presentan formas de resistencia que lles permiten vivir longos períodos de tempo fóra do corpo. Nun ambiente sen ningunha amplificación específica, as bacterias dominantes deben ser as correspondentes á flora bacteriana normal humana, principalmente bacterias gram positivas pertencentes aos xéneros Micrococcus e Staphylococcus. Unha concentración ambiental elevada destes tipos de bacterias é indicativa de que os niveis de ocupación son elevados e a renovación de aire insuficiente. O predominio de bacterias gram negativas indica, pola súa banda, a existencia de focos de contaminación inusuais dende os que se produce a diseminación: augas estancadas e contaminadas, ou de extraccións dos lavabos, etc. Algúns autores suxeriron a cifra de unidades formadoras de colonias (UFC)/m 3, como límite superior de concentración de bacterias totais para interiores en climas 255

241 CRITERIOS DE VALORACIÓN subárticos. Esta cifra só é aplicable para organismos de orixe humana, excluíndo calquera tipo de patóxenos. Tampouco é aplicable para climas cálidos. Nun protocolo elaborado polo Comité sobre Bioaerosois da ACGIH para ambientes de oficinas, establécese un modo de actuación en función da concentración ambiental de axentes biolóxicos. Segundo o mencionado protocolo, se a concentración supera as UFC/m 3, hanse de aplicar de inmediato unha serie de medidas correctoras que se describen no propio protocolo. Mentres que se a concentración é inferior ás UFC/m3, recomenda identificar os posibles axentes etiolóxicos, pertencentes tanto a bacterias como a actinomicetos ou fungos, e aplicar as medidas correctoras se algún deles excede as 500 UFC/m 3. Establécense, pois, á hora de tomar medidas correctoras, o nivel xeral de UFC/m 3 e, para os casos en que non se alcance, o nivel de 500 UFC/m 3 para algún dos axentes identificados (Berenguer et alii, 1994). Ben entendido que estes niveis son aplicables para axentes non infecciosos e sempre que non existan traballadores que estean sensibilizados contra eles ou os seus produtos. Existen guías para axentes específicas, como por exemplo, a da OSHA (Occupational Safety & Health Administration de EE. UU.) que, referida a Legionella, serve para avaliar a efectividade do mantemento do sistema de auga. Para utilizar esta guía hai que ter en conta os seguintes aspectos: 1. Es aplicable a sistemas de agua usados por individuos sanos. 2. Los niveles de acción varían según la fuente de exposición. 3. El objetivo es conseguir cero UFC de Legionella. Guía para evaluar la efectividad del mantenimiento del sistema de agua 256

242 CRITERIOS DE VALORACIÓN Unidades formadoras de colonia (UFC) de Legionella /ml Torre refrixeración Auga doméstica Humidificador Acción Acción Acción 1: Limpeza rápida do sistema e/ou tratamento con biocidas. Acción 2: Limpeza inmediata e/ou tratamento con biocidas. Tomar rápido medidas para previr a exposición dos traballadores. ENDOTOXINAS As endotoxinas son compoñentes (lipopolisacáridos) das membranas externas das bacterias gram negativas. Son compostos altamente tóxicos que poden causar febre e malestar, alteracións no número de leucocitos, alteracións respiratorias, etc. Os niveis de endotoxinas en ambientes interiores poden ser de entre 100 e veces superiores aos niveis medidos nos ambientes de control. Rylander (1994) suxire as seguintes pautas para establecer límites para as endotoxinas, a partir dos efectos que producen: Límite de endotoxina μg/m 3 neumonite tóxica 1-2 opresión torácica entre os traballadores 0 3 diminución do volume espiratorio forzado 0 2 inflamación das vías respiratorias con incremento de reactividade 0 02 A Guía técnica para a evaliación e prevención dos riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos do INSHT (2003) sinala que na actualidade se admite un límite máximo de exposición profesional a endotoxinas de 200 ng/m

243 CRITERIOS DE VALORACIÓN FUNGOS Os fungos son organismos ubicuos, comúns sobre o chan ou a vexetación. A orixe dos fungos que habitualmente se atopan nos ambientes interiores é maioritariamente do exterior, polo que preferentemente se utilizará este como ambiente control. Cando un edificio sofre danos como consecuencia de fugas de auga ou humidades, os microorganismos habituais son substituídos por fungos e outros microorganismos que requiren unha maior actividade de auga para se desenvolveren. Dende o punto de vista da hixiene industrial pode non ser tan importante determinar a concentración ambiental de fungos, abonde lembrar que, en condicións normais, en locais ventilados mecanicamente a concentración fúnxica é normalmente inferior á do ambiente exterior, como o tipo de especies que a constitúen e o seu poder irritante e toxixénico. A liberación das esporas varía coa humidade e outras condicións locais no lugar de crecemento, polo que a medición realizada nun determinado momento pode non ser válida para outro. A tendencia actual é que o principal foco de atención á hora de valorar o risco microbiolóxico se baseará máis na identificación das cepas microbiolóxicas que se atopan as superficies e menos no reconto total de esporas no aire (Husman, 1996). Cooley et alii (1998) atoparon niveis de concentración ambiental de fungos, expresados como UFC/m3, significativamente menores en ambientes interiores que no ambiente exterior que fora tomado como referencia. As especies que aparecían e as súas frecuencias relativas presentaban perfís similares. Naqueles ambientes que se relacionan con problemas de saúde descubriron que as especies pertencentes aos xéneros Penicillium e Aspergillus tiñan unha concentración superior á do ambiente exterior e á das áreas nas que non se detectaron problemas de saúde. Estes lugares correspondíanse cun escaso mantemento do sistema de calefacción e 258

244 CRITERIOS DE VALORACIÓN aire acondicionado e coa presenza de fugas de auga. Despois do tratamento destas zonas, os niveis fúnxicos descenderon ata alcanzar valores un 50-90% menores que as das mostras exteriores. É significativo destacar que se ben se illou Stachybotrys chartarum a partir de mostras tomadas en zonas de crecemento visibles sobre a superficie de materiais, esta especie non se illou a partir das mostras ambientais. As diferenzas nas relacións entre os fungos do interior e do exterior dependen, fundamentalmente, do sistema de ventilación dispoñible. Esta relación é practicamente idéntica cando o edificio está ventilado de forma natural, mentres que, en edificios ventilados de forma mecánica, mesmo nos que o sistema de ventilación é deficiente, a concentración de fungos atopados no interior debería ser inferior á presente no exterior. En calquera caso, as especies atopadas no interior deberían corresponder ás especies do exterior propias da estación climática. A identificación dos xéneros depende en boa medida do método de mostraxe e do medio de cultivo utilizadas. Para obter unha maior confianza sobre os niveis de exposición recoméndase a realización de mostraxes múltiples e repetidas. Os niveis de ata 100 UFC/m 3 de fungos saprófitos poden considerarse normais, sempre e cando se trate de ambientes nos que non existe poboación con deficiencias ou enfermidades do sistema inmunitario. A OSHA considera que niveis maiores que UFC/m 3 son inaceptables, non obstante, os estudos que tratan de establecer os niveis de fungos existentes en diferentes edificios indican que estes niveis son superados nunha elevada porcentaxe de casos, tal e como demostra o traballo de compilación realizado por Gots et alii (2003). Na táboa 11 indícanse as recomendacións para concentracións de fungos que dan distintas organizacións de relevancia mundial. Na devandita táboa pódense apreciar falta de unanimidade en canto aos valores recomendados. 259

245 CRITERIOS DE VALORACIÓN TÁBOA 11. Recomendacións para concentracións de fungos ORGANIZACIÓN RECOMENDACIÓN American < 100 UFC/m 3 BAIXO Conference of UFC/m 3 INTERMEDIO, representa os valores Industrial de concentración externos e internos xerais Hygienists > UFC/m 3 - ALTO American Industrial Recomenda a comparación da orde de rangos entre Hygiene Association o ambiente exterior e o interior U. S. Occupational UFC/m 3 - CONTAMINACIÓN Safety and Helth 10 6 fungos/g po CONTAMINACIÓN Administration 10 6 fungos/ml de auga estancada ou lama CONTAMINACIÓN World Health Patoxénicas e toxixénicas inaceptables no aire interior Organization > 50 UFC/m 3, unha especie - INVESTIGAR 150 UFC/m 3, especies mesturadas OK 500 UFC/m 3, se Clasdosporium ou outros phylloplane comúns-ok Estruturas residenciais: > UFC/m 3 MOI ALTO < UFC/m 3 ALTO <1.000 UFC/m 3 INTERMEDIO Commission < 200 UFC/m 3 BAIXO of European <50 UFC/m 3 MOI BAIXO Committees Estruturas non industriais, comerciais: > UFC/m 3 MOI ALTO < UFC/m 3 ALTO < 500 UFC/m 3 INTERMEDIO < 100 UFC/m 3 BAIXO < 25 UFC/m 3 MOI BAIXO IAQ Association Inc. < 300 UFC/m 3 de fungos comúns OK < 150 UFC/m 3 especies mesturadas, non patóxenas o toxixénicas - OK Modificada de Gots et alii (2003) 260

246 CRITERIOS DE VALORACIÓN MICOTOXINAS As micotoxinas son metabolitos secundarios, tóxicos para os animais e o home, que producen os fungos durante os procesos de destrución da materia orgánica, utilizada como fonte de enerxía. As micotoxinas absórbense por vía aérea e a través da pel xa que a maioría delas son lípidos solubles. A exposición a estes compostos relaciónase, basicamente, con ambientes agrícolas e co almacenamento de gran. Os efectos para a saúde que foron descritos refírense á súa potencialidade para inducir procesos canceríxenos, á deterioración do sistema inmunitario e aos danos que producen en diversos órganos como son o corazón, o fígado ou os riles. Os efectos producidos polos tricotecenos débense ás súas accións a nivel subcelular, onde inhiben a síntese de proteínas e danan o ADN, e a nivel celular, xa que son tóxicos para a maioría das células eucarióticas, en particular, as do sistema inmune. En doses baixas causan irritación da pel con arroibamento e, a concentracións elevadas, destrúen capas da pel e causan necrose aguda con mínima inflamación. A necrose e inflamación son rápidas cando afectan a mucosa da boca, esófago e intestino. Na actualidade disponse dalgúns datos sobre as doses a que algunhas micotoxinas producen efectos adversos para a saúde. Diversos tricotecenos caracterízanse por ter doses letais para o 50% dos individuos expostos inferiores a 1 mg/kg (vía dixestiva). A aparición de efectos crónicos (cancro) en relación coa exposición a aflatoxinas pode acontecer a doses de concentración de µg/kg. É bastante probable que os efectos crónicos causados pola exposición a micotoxinas sexan amplificados cando a vía de entrada no organismo é a inhalatoria. A identificación e avaliación dos riscos debidos á exposición a micotoxinas é complexa e require, en xeral, da mostraxe tanto dos fungos que as producen coma de cada tipo de micotoxinas. O feito de atopar fungos produtores de micotoxinas en mostras ambientais non sempre é evidencia 261

247 CRITERIOS DE VALORACIÓN PROTOZOOS de que exista exposición a estas. Non obstante, o feito de atopar niveis inusuais de fungos toxixénicos debería ir acompañado da mostraxe ambiental de toxinas específicas. Por outra parte, moitas das cepas dos fungos denominados toxixénicos non producen micotoxinas dunha forma rutineira e algúns só as producen en condicións de laboratorio. En mostraxes ambientais con medios de cultivo inespecíficos, algúns destes fungos non poden competir con outras especies, polo que os niveis de fungos toxixénicos obtidos son inferiores aos ambientais reais. Cooley et alii (1998) sinalan a dificultade de illar especies de Stachybotrys do aire e suxiren que, cando as especies fúnxicas das mostras tomadas en áreas nas que se detectaron problemas de saúde atribuíbles á presenza de fungos toxixénicos, é similar á exterior ou á doutra área control sen problemas, se se dan condicións de elevada humidade, poden existir no ambiente micotoxinas producidas por fungos como Stachybotrys, que poden estar ocultos e crecendo no interior do local. Outras especies non implicadas na produción de trastornos aos traballadores poden ser indicativas da existencia de condicións que potencialmente poderían favorecer o crecemento doutros xéneros como Aspergillus e Penicillium. ANTÍXENOS O tamaño dos protozoos fai pouco probable a súa presenza nos bioaerosois xa que tenden a sedimentar rapidamente. Se existise evidencia dalgún tipo de problema que poida estar relacionado con organismos patóxenos pertencentes a este grupo de axentes biolóxicos, débense analizar os seus reservorios (humidificadores, augas estancadas), para determinar a orixe do problema e eliminar os focos de contaminación. A alerxia ao po doméstico coñécese dende hai décadas, pero foi nos últimos anos cando se produciu un avance importante na identificación, purificación e caracterización 262

248 CRITERIOS DE VALORACIÓN dos antíxenos producidos polos ácaros do po doméstico. Algúns autores propuxeron uns valores de antíxenos de ácaros en po que poden causar sensibilización e a aparición de síntomas en persoas sensibilizadas. O nivel de sensibilización para os antíxenos dos ácaros do po estableceríase en 2 µg/g de po, mentres que os 10 µg/g constituirían o nivel a partir do cal se apreciarían signos clínicos nos individuos sensibilizados. Propuxéronse outros valores límite, por enriba dos que se pode producir sensibilización. Así, suxeriuse 8 µg/g para alérxenos procedentes de gatos, Felis domesticus (Fel d I), 10 µg/g para os procedentes dos cans, Canis familiaris (Can f I), e de 2 µg/g para os alérxenos de cascudas, Blatella germanica (Bla g I) (American Industrial Hygiene Association, 1996). Non obstante, aínda non se propuxeron valores límite de concentración para antíxenos ambientais procedentes de microorganismos. Sábese que doses moi baixas de antíxeno poden producir reaccións en individuos sensibilizados polo que non existen en realidade valores de concentración seguros para esas persoas sensibilizadas. Pode suceder que un edificio sexa seguro para os ocupantes non sensibilizados, pero non para aquelas persoas que desenvolvesen a enfermidade a consecuencia da súa permanencia no edificio. Concentración μg Der p I/g ou Der f I/g de po* Nivel de risco <2 Baixo 2-10 Significativo >10 Alto * Der p I e Der f I son antíxenos dos ácaros do po Dermatophagoides pteronissinus e D. farinae, respectivamente. A aplicación de medidas de control que rebaixen os niveis ambientais de antíxeno interesa dende dous puntos de vista. O primeiro deles é, tendo en conta que os niveis moi baixos de antíxeno non constitúen probablemente un risco de sensibilización para novos pacientes, diminuír o número de sensibilizacións reducindo os niveis de antíxeno. En 263

249 CRITERIOS DE VALORACIÓN segundo lugar, interesa reducir ao mínimo os niveis de antíxeno para tratar de evitar que os individuos sensibilizados reaccionan fronte a eles. 264

250 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS

251 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS O hixienista industrial ha de realizar unha avaliación de riscos, identificando e valorando os contaminantes físicos, químicos e biolóxicos, e, finalmente, ha de planificar a acción preventiva, para eliminar os devanditos contaminantes ou rebaixar a súa presenza a niveis tolerables. O establecemento dunha acción preventiva de riscos integrada na empresa, en correspondencia co artigo 2 do Real decreto 39/1997, polo que se aproba o Regulamento dos servizos de prevención (acción da empresa en materia de prevención de riscos), supón a implantación dun plan de prevención de riscos que inclúa a estrutura organizativa, a definición de funcións, as prácticas, os procedementos, os procesos e os recursos necesarios para levar a cabo a devandita acción. Outro dos piares fundamentais sobre os que se apoia a prevención de riscos laborais é a información e formación dos traballadores, que ha de ser suficiente e adecuada en función do posto de traballo, e ha de facer referencia aos riscos existentes e aos medios e procedementos necesarios para previlos. O Real decreto 664/1997, sobre a protección dos traballadores contra os riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos durante o traballado, establece: Se os resultados da avaliación revelan que a actividade non implica intención deliberada de manipular axentes biolóxicos ou de utilizalos no traballo pero pode provocar a exposición dos traballadores axentes, hanse de aplicar as disposicións dos artigos 5 ao 13 deste real decreto, salvo que os resultados da avaliación o fixesen innecesario (artigo 4.5). Neste sentido, o artigo 5 do mencionado real decreto refírese a evitar a utilización de axentes biolóxicos perigosos mediante a súa substitución por outros axentes que, en función das condicións de utilización, non sexan perigosos para a seguridade ou saúde dos traballadores, ou que o sexan en menor grao. Esta substitución levarase a cabo, cando a natureza da actividade o permita, tendo en conta a información técnica e científica dispoñible. 267

252 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Este artigo é conforme cun dos principios fundamentais da acción preventiva en hixiene industrial: evitar o risco na súa orixe. Sempre debe primar a substitución de produtos químicos e axentes biolóxicos perigosos por aqueles que non sexan perigosos ou que o sexan en menor grao. É norma básica actuar sobre a fonte que orixina o perigo, eliminándoa, antes que buscar a solución nos medios de protección colectivos ou individuais. Neste sentido, o artigo 15 da Lei 31/95, de prevención de riscos laborais, "Principios da acción preventiva", sinala, no seu apartado 1º, os principios xerais que deberán terse en conta á hora de aplicar as medidas preventivas, e, entre eles, os seguintes: - Evitar os riscos - Combater os riscos na súa orixe - Substituír o perigoso polo que entrañe pouco ou ningún risco. Seguindo o Real decreto 664/1997, o artigo 6 refírese á redución dos riscos. Di que: se os resultados da avaliación a que se refire o artigo 4 puxesen de manifesto un risco para a seguridade ou saúde dos traballadores por exposición a axentes biolóxicos, deberá evitarse a devandita exposición. Cando iso non resulte factible por motivos técnicos, habida conta da actividade desenvolvida, reducirase o risco de exposición ao nivel máis baixo posible para garantir axeitadamente a seguridade e saúde dos traballadores afectados, en particular por medio das seguintes medidas: 1. Establecemento de procedementos de traballo adecuados e utilización de medidas técnicas apropiadas para evitar ou minimizar a liberación de axentes biolóxicos no lugar de traballo. 2. Redución, ao mínimo posible, do número de traballadores que estean ou poidan estar expostos. 3. Adopción das medidas seguras para a recepción, manipulación e transporte dos axentes biolóxicos dentro do lugar de traballo. 4. Adopción de medidas de protección colectiva ou, no seu defecto, de protección individual, cando a exposición non poida evitarse por outros medios. 268

253 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS 5. Utilización de medios seguros para a recollida, almacenamento e evacuación de residuos polos traballadores, incluído o uso de recipientes seguros e identificables, logo do tratamento adecuado se fose necesario. 6. Utilización de medidas de hixiene que eviten ou dificulten a dispersión do axente biolóxico fóra do lugar de traballo. 7. Utilización dun sinal de perigo biolóxico como a indicada no anexo III do real decreto citado, así como outros sinais de advertencia pertinentes. 8. Establecemento de plans para facer fronte a accidentes dos que poidan derivarse exposicións a axentes biolóxicos. 9. Verificación, cando sexa necesaria e tecnicamente posible, da presenza dos axentes biolóxicos utilizados no traballo fóra do confinamento físico primario. A prevención de riscos laborais ten por obxectivo fundamental evitar o risco, eliminando a exposición, e, só no caso de que isto non sexa posible, reducir o risco actuando sobre os dous aspectos que o conforman, é dicir, diminuíndo a probabilidade de que se produza o dano e a súa severidade. Á hora de poñer en práctica a acción preventiva, outro dos principios básicos é ter en conta a evolución da técnica (o art e) da Lei de prevención de riscos laborais). Na prevención de riscos laborais é moi importante establecer procedementos de traballo claro nos que estean perfectamente determinados os traballadores que han de realizar unha determinada tarefa e o modo de realizala. Debe prepararse o persoal sobre o modo de recibir, manipular e transportar os axentes biolóxicos ou as mostras que poidan contelos, así como, posteriormente, sobre o modo de recoller, manipular e tratar os residuos. As normas deben ser detalladas e coñecidas polo persoal. Deberán identificarse aqueles traballadores para os que poida ser necesario aplicar medidas especiais de protección. Así, o art. 25 da Lei de prevención de riscos laborais trata da protección dos traballadores especialmente sensibles a determinados riscos. Nel indícase que: 269

254 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS O empresario garantirá de xeito específico a protección dos traballadores que, polas súas características persoais ou estado biolóxico coñecido, incluídos aqueles que teñan recoñecida a situación de minusvalidez física, psíquica ou sensorial, sexan especialmente sensibles aos riscos derivados do traballo. Para tal fin deberá ter en conta os devanditos aspectos nas avaliacións dos riscos e, en función destas, adoptará as medidas preventivas e de protección necesarias. (art. 25.1) Os artigos 26 e 27 da Lei 31/1995 ocúpanse da protección da maternidade e dos menores. O artigo 7 do Real decreto 664/1997 establece as medidas hixiénicas que se deberán seguir e os requisitos que se deberán cumprir en canto á organización e procedementos de traballo, dispoñibilidade de roupa de protección persoal en correcto estado de funcionamento e separación entre áreas limpas e aquelas potencialmente contaminadas. Entre estas medidas hixiénicas inclúense: a prohibición de comer, beber ou fumar nas zonas de traballo nas que exista risco por axentes biolóxicos; o aseo persoal antes da comida e antes de abandonar o traballo; quitar as roupas de traballo e os equipos de protección persoal que poidan estar contaminados por axentes biolóxicos ao saír da zona de traballo e gardalos en lugares que non conteñan outros equipos. Considérase ademais a necesidade de dispoñer de roupa e de equipos de protección axeitados que se limpan e se comproban despois de cada utilización, prestándolle tamén atención ao seu almacenamento correcto. O empresario responsabilizarase do lavado, descontaminación e, en caso necesario, destrución da roupa de traballo e dos equipos de protección. Tamén se refire, aínda que en menor medida, aos aspectos de organización da actividade, e encoméndalle ao empresario adoptar as medidas encamiñadas a especificar os procedementos de obtención, manipulación e procesamento de mostras de orixe humana ou animal (art. 7.1.e)). Outro aspecto importante na prevención dos riscos por axentes biolóxicos é a vixilancia da saúde. Esta, realizada por 270

255 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS persoal sanitario con competencia técnica, formación e capacidade acreditada (apartado 3 do artigo 37 do Real decreto 39/1997), ten por obxecto garantir o bo estado de saúde dos traballadores. A composición dos equipos encargados da vixilancia da saúde establécese no Real decreto 39/1997, polo que se aproba o Regulamento dos servizos de prevención. Estes equipos deberán contar cun médico especialista en medicina do traballo ou diplomado en medicina de empresa e un ATS/DUE de empresa, sen prexuízo da participación doutros profesionais sanitarios con competencia técnica, formación e capacidade acreditada. A vixilancia da saúde deberá ofrecerse aos traballadores (artigo 8.1 do Real decreto 664/1997) nas seguintes ocasións: a) Antes da exposición. b) A intervalos regulares a partir deste intre, coa periodicidade que os coñecementos médicos aconsellen, considerando o axente biolóxico, o tipo de exposición e a existencia de probas eficaces de detección precoz. c) Cando sexa necesario por se ter detectado nalgún traballador, con exposición similar, unha infección ou enfermidade que poida deberse á exposición a axentes biolóxicos. En materia de vixilancia da saúde, a actividade sanitaria deberá abranguer, nas condicións fixadas polo artigo 22 da Lei 31/1995, de prevención de riscos laborais (artigo 37.3 do Real decreto 39/1997): 1.- Avaliación da saúde dos traballadores inicial despois da incorporación ao traballo ou despois da asignación de tarefas específicas con novos riscos para a saúde. 2.- Unha avaliación da saúde dos traballadores que continúen o traballo logo dunha ausencia prolongada por motivos de saúde, coa finalidade de descubrir as súas eventuais orixes profesionais e recomendar unha acción apropiada para protexer os traballadores. 271

256 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS 3.- Unha vixilancia da saúde a intervalos periódicos. Un bo programa de vixilancia da saúde permite descubrir con maior celeridade a infección nun traballador, mesmo naqueles casos en que as enfermidades presentan un longo período de latencia. Neste sentido a vixilancia da saúde presenta unha dobre vantaxe. En primeiro lugar, permite comezar a aplicar o tratamento axeitado ao traballador mesmo antes de que comecen a manifestarse os síntomas da enfermidade. En segundo lugar, no ámbito colectivo, que un traballador contraia unha enfermidade como consecuencia da súa actividade profesional ponnos sobre aviso da existencia dalgún fallo na avaliación de riscos ou na planificación preventiva. Cando isto suceda, será obrigatorio realizar unha investigación para determinar as causas (art da Lei de prevención de riscos laborais) e realizarase unha nova avaliación de riscos (art. 4.2 do Real decreto 664/1997). O Ministerio de Sanidade e Consumo publicou ata o de agora tres protocolos de vixilancia sanitaria específica que poden ser de aplicación a traballadores expostos a contaminantes biolóxicos. - Protocolo de vixilancia sanitaria específica para os traballadores expostos a axentes biolóxicos. Protocolo de vixilancia sanitaria específica para neumonite por hipersensibilidade ou alveolite alérxica extrínseca. Protocolo de vixilancia sanitaria específica para asma laboral. O persoal sanitario do servizo de prevención estudará e valorará especialmente os riscos que poidan afectar as traballadoras en situación de embarazo ou parto recente, os menores e os traballadores especialmente sensibles a determinados riscos, e proporá as medidas preventivas axeitadas (art f) do Real decreto 39/1997). O mesmo artigo 8 do Real decreto 664/1997, no seu apartado 2, establece que os traballadores poderán solicitar a revisión dos resultados da vixilancia da súa saúde. E, no 272

257 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS apartado 3: que cando exista risco por exposición a axentes biolóxicos para os que haxa vacinas eficaces, estas deberán poñerse á disposición dos traballadores, informándoos das vantaxes e inconvenientes da vacinación. O Anexo VI deste real decreto indica unhas recomendacións prácticas para a vacinación. Cando a avaliación de riscos demostre a existencia dun risco para a seguridade e a saúde dos traballadores por exposición a axentes biolóxicos contra os que existan vacinas eficaces, o empresario deberalle ofrecer ao traballador a devandita vacina, informándoos das vantaxes e inconvenientes tanto da vacinación coma da non vacinación. A vacinación deberá efectuala o persoal sanitario do Servizo de Prevención e será este servizo quen informe os traballadores sobre os riscos da exposición ao axente biolóxico implicado, enfermidade que produce, así como dos riscos (reaccións adversas, contraindicacións) e beneficios da vacinación recomendada. A vixilancia da saúde continuará, se fose necesario, despois de finalizada a relación laboral. Sobre este punto aconsellaranse e informaranse os traballadores no relativo a calquera control médico que sexa pertinente efectuar con posterioridade ao cesamento da exposición (artigo 8.6 Real decreto 664/1997). A devandita vixilancia posterior á finalización da relación laboral levarase a cabo a través do Sistema Nacional de Saúde (art e do Real decreto 39/1997). Os artigos seguintes refírense a: documentación (art. 9), notificación á autoridade laboral (art. 10), información ás autoridades competentes (art. 11), información e formación dos traballadores (art. 12) e consulta e participación dos traballadores (art. 13). Os establecementos sanitarios e veterinarios distintos dos laboratorios de diagnóstico teñen un tratamento particular no artigo 14 do Real decreto 664/1997. Neste tipo de establecementos han de terse en conta os riscos inherentes ás 273

258 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS actividades que desenvolven e, en especial, a incerteza sobre a presenza de axentes biolóxicos nos pacientes humanos, os animais e os materiais ou mostras procedentes deles. As medidas que se han de tomar para garantir a protección dos traballadores comprenderán a especificación de procedementos apropiados de descontaminación e desinfección e a aplicación de procedementos que permitan manipular e eliminar sen riscos os residuos contaminados. Pola súa banda, no artigo 15 establécense as medidas especiais aplicables aos procedementos industriais, aos laboratorios e aos locais para animais. Estes establecementos e procesos han de cumprir cunha serie de medidas de contención, establecidas nos anexos IV e V do propio real decreto, en función do grupo de clasificación a que pertencen os axentes biolóxicos utilizados ou que se sospeite que poden estar presentes. Os laboratorios que realicen traballos que impliquen a manipulación de axentes biolóxicos dos grupos 2, 3 e 4 con fins de investigación, desenvolvemento, ensino ou diagnóstico deberán establecer as medidas de contención de acordo co anexo IV do Real decreto 664/1997. As actividades que supoñan a manipulación dun axente biolóxico executaranse unicamente en zonas de traballo que correspondan, polo menos, ao nivel de contención igual ao grupo a que pertence o devandito axente, é dicir, nivel de contención 2 para axentes do grupo 2, nivel de contención 3 para axentes do grupo 3, e niveis de contención 4 para axentes do grupo 4. Os laboratorios que, sen ter intención de traballar con eles como tales (cultivándoos ou concentrándoos), manipulen materiais sobre os que existe incerteza de que poidan conter axentes biolóxicos que poidan causar enfermidade no home, deberían adoptar, polo menos, o nivel 2 de contención. Será necesaria a utilización de niveis de contención superiores sempre que se saiba ou sospeite que son necesarios. 274

259 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Os procedementos industriais que utilicen axentes biolóxicos dos grupos 2, 3 ou 4 deberán tomar medidas de contención de conformidade co anexo V do Real decreto 664/1997. MEDIDAS DE CONTROL DOS AXENTES BIOLÓXICOS Ademais das directrices expostas no Real decreto 664/1997 sobre a protección dos traballadores contra os riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos durante o traballo, e dende un punto de vista práctico, imos analizar a continuación as medidas de control aplicables para os axentes biolóxicos. No caso das enfermidades producidas por axentes infecciosos, como sinalan Lee e Johnson (1997), para que se produza unha enfermidade ou un dano ao traballador, é necesario que se dean seis condicións que completan o que eles denominan a cadea da infección (figura 13). Estas condicións son: 1. o axente debe ser patóxeno 2. debe existir un reservorio cun número suficiente de organismos vivos e reprodutivos 3. o axente debe ser capaz de escapar do reservorio 4. o organismo debe ser capaz de se mover a través do medio (aire, contacto, vectores) 5. debe existir unha porta de entrada no nuevo hospedador (roturas na pel, membrana mucosa, inhalación, transferencia sanguínea) 6. o nuevo hospedador debe ser susceptible ao axente. Se algunha das condicións anteriores non se cumpre, non terá lugar a enfermidade. A prevención suporá romper esa cadea en calquera dos seus elos, empezando, sempre que sexa posible, en sentido de: eliminar o foco, actuar no medio de transmisión e, finalmente, protección persoal. As medidas de control basearanse, en primeiro lugar, en eliminar o axente biolóxico patóxeno do medio, ben por substitución por outro axente, cando iso sexa posible 275

260 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS dentro dunha actividade produtiva, ben a través do establecemento de procedementos de traballo que impidan a emisión de bioaerosois, ben mediante a aplicación de medidas de contención que impidan a súa saída fóra do recinto en que se manexan. Como xa se indicou, no caso dunha actividade na que existe risco por axentes biolóxicos, sempre que sexa posible substituiranse os axentes biolóxicos perigosos por outros que non o sexan ou o sexan en menor grao. Isto, claro está, cando é o propio proceso produtivo o que precisa da utilización do axente. Non obstante, cando a presenza deste é allea ao proceso produtivo, as medidas preventivas encamiñaranse, en primeiro lugar, a eliminar o devandito axente, o que pode conseguirse mediante a aplicación de medidas de limpeza, desinfección e esterilización. Nestes casos actuamos sobre o primeiro elo da cadea da infección: o axente patóxeno. Para evitar o crecemento de fungos, ademais de controlar o exceso de humidade, deben manterse as zonas sensibles limpas e secas. Deben previrse os problemas de condensación, utilizando deshumidificadores ou acondicionadores de aire. O obxectivo é claro, hai que eliminar os factores que favorecen o crecemento posto que é moi difícil eliminar o axente completamente. Supoñamos, por exemplo, que a efectividade dun biocida é do 99'999%, se a densidade de esporas é de 10 5 esporas/cm 2, aínda quedará unha espora que pode, en condicións óptimas, servir de foco inicial de multiplicación do axente. 276

261 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Figura 13.- A cadea da infección (Lee e Johnson, 1997) Patóxeno Reservorio Saída do reservorio Transmisión a través do medioambiente Vía de entrada Hospedador susceptible ACTUACIÓNS SOBRE O AXENTE BIOLÓXICO Limpeza Para manter os contaminantes biolóxicos a niveis aceptables é imprescindible realizar unha limpeza e, en ocasións, unha desinfección e esterilización adecuadas do lugar de traballo e dos materiais utilizados. A limpeza serve para rebaixar os niveis microbiolóxicos das superficies ou instrumentos. A maior ou menor acción bactericida dos deterxentes (axentes tensioactivos) vai depender da súa composición. Así, os deterxentes non iónicos non son bactericidas e mesmo poden servirlles de alimento ás bacterias. Os deterxentes aniónicos son bactericidas débiles, pois son repelidos pola carga negativa neta da superficie bacteriana, mentres que os deterxentes catiónicos son activos 277

262 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Desinfección contra toda clase de bacterias. Os deterxentes actúan disgregando a membrana celular e disolvendo as películas lipídicas que protexen as bacterias. A limpeza ha de ser sempre un paso previo á desinfección posto que esta non sería efectiva se non vai acompañada dunha limpeza exhaustiva que elimine a materia que pode rebaixar a efectividade do desinfectante. Se as superficies ou materiais non están limpos pode suceder que o desinfectante non chegue a alcanzar o axente biolóxico ou que, como lle sucede ao cloro, se consuma coa materia orgánica. Como se pode ver, coa limpeza e co emprego de deterxentes pódese reducir considerablemente a flora microbiana, non obstante, se queremos eliminar dunha forma segura o risco infeccioso, teremos que recorrer a técnicas de desinfección ou de esterilización. Ao falar de desinfección facemos referencia normalmente ao emprego de axentes químicos xermicidas que destrúen a infectividade potencial dun material, pero que non supoñen a eliminación de todos os microbios viables. Pola súa banda, a esterilización baséase na utilización tanto de axentes físicos como químicos para eliminar todos os microbios viables, incluídas as formas resistentes. A desinfección de instrumentos e superficies, sobre todo nos laboratorios que manexan mostras biolóxicas, considérase a forma máis axeitada para evitar un posible contaxio. Non obstante, o manexo destes produtos require un coñecemento das súas características de perigosidade e os seus valores límite de exposición, para evitar os riscos inherentes a estes; así como do tempo e concentración necesarios, en función dos microorganismos de que se trate, para que a súa aplicación sexa eficaz. Martí et alii (1996) realizan unha revisión dos desinfectantes químicos máis correntes para instrumentos e superficies dos postos de traballo con risco biolóxico. O produto desinfectante debe ter un amplo espectro de actividade e unha acción rápida e irreversible. Unha correcta aplicación do desinfectante permitirá un bo contacto entre o desinfectante e a superficie para desinfectar. 278

263 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Moitos desinfectantes teñen características de toxicidade importantes para o home ou os animais. Non obstante, aplicado correctamente, o produto non ha de supoñer ningún risco de toxicidade, polo que se deben seguir sempre as instrucións para a súa aplicación contidas na etiqueta e fichas de datos de seguridade. Os desinfectantes que se utilicen deben estar axeitadamente etiquetados segundo a normativa correspondente (Real decreto 1078/1993 e Real decreto 363/1995 e as súas posteriores modificacións), tanto se se adquiriron comercialmente, coma se son de preparación propia. Algúns dos desinfectantes químicos de uso máis corrente son: a) Auga osixenada (peróxido de hidróxeno). É un axente oxidante utilizado amplamente, non obstante, hai que ter en conta que a súa efectividade contra as bacterias é moi variable xa que algunhas especies posúen catalasa. b) Alcoles: alcol etílico (etanol), alcol isopropílico (isopropanol). A acción desinfectante dos alcohois alifáticos aumenta coa lonxitude da cadea ata 8 átomos de carbono, a partir desta lonxitude diminúe moito a solubilidade en auga. Aínda que o etanol é moi utilizado, o alcohol isopropílico presenta certas vantaxes sobre aquel, como son a súa maior potencia desinfectante e a súa menor volatilidade. Os alcohois son volátiles e inflamables. c) Aldehidos: formaldehido, glutaraldehido. Son axentes alquilantes, cuxa acción está ligada á desnaturalización das proteínas e dos ácidos nucleicos. Son eficaces contra fungos, bacterias e virus. O formaldehido é un canceríxeno sospeitoso e o glutaraldehido é tóxico e irritante para a pel e as mucosas. d) Cloro. Utilizado xeralmente en forma de hipoclorito sódico con diversas concentracións de cloro libre, é un potente axente oxidante. O cloro é un desinfectante de acción rápida para os materiais limpos, pero é menos satisfactorio cando hai presenza de materia orgánica. O cloro gas é altamente tóxico. e) Compostos fenólicos. O fenol actúa a través da desnaturalización das proteínas e da súa acción deterxente. A 279

264 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS actividade antibacteriana aumenta mediante a substitución no anel con halóxenos ou alquilos que incrementan a solubilidade do grupo OH fenólico, sendo o resto da molécula máis hidrófoba, co que resulta máis tensioactivo. f) Iodo e iodóforos. O iodo combínase irreversible coas proteínas e é oxidante. O iodo pode ser tóxico. g) Ácido peracético. h) Compostos de amonio cuaternario (coñecidos coma quats ). A súa actividade xermicida vese reducida en presenza de materia orgánica, augas duras e presenza de deterxentes aniónicos. i) Metais pesados, principalmente mercurio (Hg) e prata (Ag) A descontaminación dos materiais que conteñen prións ha de ter en conta a natureza destes. Non se trata de microorganismos senón que se cre que se trata de proteínas de carácter infeccioso. Estes axentes infecciosos son inusualmente resistentes á inactivación pola maioría dos axentes físicos e químicos e os materiais que son sospeitosos deben someterse a un tratamento específico antes de ser eliminados (OMS, 2003). Os datos dispoñibles indican que os prións poden ser inactivados por unha solución de 2 mol/litro de hidróxido sódico (NaOH) que conteña 4 mol/litro de clorhidrato de guanidina (HNC(NH 2 ) 2 HCl) ou isocianato de guanidina (HNC(NH 2 ) 2 HNCO) e hipoclorito sódico (NaOCl) ( 2% de cloro libre) seguido por autocravado con vapor a 132º C durante 4'5 horas. Esterilización O emprego de determinados instrumentos e materiais, así como a eliminación de determinados residuos, esixen unha esterilización previa. A esterilización destrúe todos os xermes, incluídas as esporas bacterianas, que poida conter un material. Existen diferentes tipos de esterilización, entre eles: 280

265 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Esterilización por calor: A calor é o método de elección para a esterilización de materiais, salvo para aqueles que poden sufrir dano como consecuencia das elevadas temperaturas. A desinfección alcanza superficies que poderían estar protexidas á acción dun desinfectante químico. Aínda que a maioría dos fungos, virus e células vexetativas bacterianas son esterilizados nuns minutos a 70º C, e moitas esporas a 100º C, existen esporas dalgunhas bacterias saprófitas que poden sobrevivir á ebulición durante horas. Cando se quere conseguir unha esterilidade absoluta, recórrese a esterilizar os materiais por vapor en autoclave. Aínda que, como xa se mencionou para os prións poden existir casos especiais, para a maioría dos propósitos, os ciclos que indicamos a continuación aseguran a esterilización na autoclave: 134 ºC durante 3 minutos 126 ºC durante 10 minutos 121 ºC durante 15 minutos 115 ºC durante 25 minutos Ao utilizar a autoclave hai que ter a precaución de que o vapor de auga desprace completamente o aire antes de producir a presión. Tamén pode levarse a cabo a esterilización por calor seca, pero neste caso a temperatura ha de ser máis alta. A esterilización de esporas por calor seca require 160º C durante 1 a 2 horas. Esterilización por radiacións: A radiación ultravioleta actúa producindo lesións no ADN celular o que ocasiona mutacións letais. Actúa principalmente a través de alteracións do ADN que bloquean a súa replicación. A maioría destas alteracións poden ser reparadas polo que a eficiencia da esterilización por radiación ultravioleta é baixa. 281

266 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS A utilización deste tipo de radiación pode ser útil para diminuír a infección aérea ou sobre superficies, pero hai que ter en conta que pode haber moitos lugares que non sexan alcanzados por estas radiacións, que ademais, teñen pouco poder de penetración. Outro tipo de radiacións utilizadas para a esterilización son as radiacións ionizantes, que teñen un elevado poder de penetración. A utilización de radiacións de tipo g ha de cumprir cunha serie de requisitos especiais como instalación radiactiva. Esterilización química: Os axentes gasosos, tales como o formaldehido ou o óxido de etileno, teñen unha actividade bactericida e esporicida no intervalo de 30-80º C. O formaldehido pode utilizarse como gas para esterilizar superficies secas. Non obstante, é absorbido polas devanditas superficies como un polímero reversible, o paraformaldehido, que pode despolimeralizarse lentamente producindo un residuo irritante. A esterilización de instrumentos ou materiais pode levarse a cabo en esterilizadores específicos que permiten obter as condicións de presión, temperatura e humidade axeitadas. O óxido de etileno tamén se usa para a desinfección gasosa de superficies secas, pero presenta certa toxicidade residual. Tamén se usa para esterilizar obxectos sensibles á temperatura. Polos riscos que presenta, sen descartar perigos de mutaxenia e carcinoxenia, este tipo de esterilización debe levarse a cabo por persoal cualificado, mediante un protocolo de actuación ben establecido e cos equipos de protección individual axeitados. As autoclaves de óxido de etileno deben ser de estanquidade contrastada, a ser posible de dobre porta con extracción por enriba da de descarga e con aireación incorporada. Deben situarse en áreas illadas, ben ventiladas e mantidas a depresión coas adxacentes, procedéndose a un control ambiental periódico da presenza en aire do composto. 282

267 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS BARREIRAS DE CONTENCIÓN Cando non é posible actuar directamente sobre o axente patóxeno, cabe a posibilidade de actuar sobre o reservorio. As medidas que se aplican teñen como finalidade eliminar os reservorios existentes ou confinalos nunha área en que poidan ser controlados de modo que se poida impedir a liberación dos axentes biolóxicos fóra da devandita área. A contención pode levarse a cabo mediante o emprego de barreiras primarias e secundarias. As barreiras primarias protexen o traballador e o medio na área inmediata onde pode producirse a exposición. As barreiras primarias inclúen as cabinas de seguridade biolóxica centrífugas seladas, caixas con luvas, habitáculos para animais con filtros HEPA, etc. Tamén a roupa de protección persoal: luvas, lentes, máscaras... son unha importante barreira primaria. As boas técnicas microbiolóxicas son así mesmo unha barreira primaria de contención. En canto ás barreiras secundarias, estas encárganse de protexer o medio exterior, incluíndo áreas fóra do recinto de traballo. Neste grupo entran aspectos relacionados co deseño do edificio (diferenzas de presión entre distintas zonas de traballo, ventilación con saída de aire a través de filtros HEPA, esterilización de efluentes líquidos, etc.) e prácticas e procedementos de traballo. No caso dos procesos industriais, nos que se manexan axentes biolóxicos a grande escala, os posibles efectos para a saúde como consecuencia da exposición aos devanditos axentes han de ser tidos en conta cando se realice o deseño do local de traballo. A maioría dos axentes biolóxicos que se utilizan na industria, sobre todo na destinada á produción de alimentos e bebidas, pertencen ao grupo 1, e aínda que é pouco probable que causen enfermidade no traballador, poden ocasionar reaccións alérxicas. Nalgúns procesos, sobre todo na industria farmacéutica, utilízanse axentes dos grupos 2, 3 e 4. Neste último caso, estableceranse medidas de contención baseadas nas propostas no anexo V do Real decreto 664/1997. A manipulación dos microorganismos que pertenzan aos grupos 2, 3 ou 4 levarase a cabo nun sistema que separe fisicamente o proceso do medio. As actividades 283

268 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS de toma de mostras, adición de materiais e transferencia de organismos viables a outro sistema realizaranse de modo que se minimice (grupo 2) ou se impida (grupos 3 e 4) a súa liberación. Igualmente han de tratarse os gases de escape do sistema para minimizar ou impedir, se é o caso, a liberación de axentes biolóxicos ao exterior. Os fluídos do sistema pechado han de ser inactivados mediante medios de eficacia probada, segundo o axente de que se trate, antes de proceder á súa retirada. Tamén os sistemas de traballo estarán deseñados tendo en conta o posible risco biolóxico. Na Guía Técnica para a avaliación e prevención dos riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos (INSHT, 2000), indícanse os puntos fundamentais con respecto a procedementos de traballo, contención primaria e secundaria e os métodos de protección persoal en procesos industriais: Procedimientos de trabajo: Antes de iniciarse o traballo con produción a grande escala, o traballador ha de recibir a oportuna información e formación que inclúa o adestramento en traballos de rutina en situacións de urxencia. Todas as operacións se realizarán segundo procedementos preestablecidos, con instrucións escritas sobre as actuacións ante accidentes ou incidentes que poidan supoñer un contacto co axente biolóxico, incluídos plans de urxencia. Onde sexa posible, deberíase implantar un sistema de vixilancia para comprobar a eficacia dos sistemas de contención (art. 7.1 i). Contención primaria: O fermentador ou recipientes e colectores equivalentes, dependendo do tipo de industria, debe ser o primeiro elemento de contención primaria, polo cal debe ser validado ante posibles verteduras. Cando o proceso requira axitación do contido do reactor, os axitadores contarán con sistema de selado único nos traballos con axentes biolóxicos do grupo 2, ou de dobre selado en caso de traballos cos grupos 3 ou

269 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Para o grupo 2 de axentes, requírese minimizar posibles escapes de organismos viables, o cal implica o emprego de ciclóns superficiais, ou tratamento con hipoclorito ou con controis de filtro. Para os grupos 3 ou 4 requírese impedir a liberación, que adoita conseguirse mediante filtros HEPA. A inoculación e a toma de mostras nos fermentadores farase impedindo a liberación de axentes se estes son dos grupos 3 ou 4, utilizando mostradores provistos de válvulas tipo diafragma, pasando o gas desprazado a través dun filtro HEPA. Débense comprobar os transdutores de presión e temperatura. Para os axentes do grupo 2 estes poderán retirarse para realizar os ensaios con facilidade. Nos grupos 3 ou 4 estes non poderán retirarse, recomendándose duplicar os transdutores como procedemento de seguridade. Os fluídos de grandes cultivos non deben ser retirados do medio sen que os organismos viables fosen desactivados. O método para eliminar o risco dependerá do tipo de produto, admitindo para a desactivación o emprego de filtros de 0.22 mm para os do grupo 2 ou aplicación de altas temperaturas ou biocidas efectivos para os grupos 3 ou 4. Contención secundaria: Sala de reactor-edificio Todos os procesos que utilicen axentes dos grupos 2, 3 e 4 deben estar deseñados para minimizar (grupo 2) ou previr (grupos 3 e 4) a liberación. O deseño debería ser de tal forma que a sala de fermentación actuase como contención secundaria e que o resto do equipo estivese situado dentro dun edificio hermético, equipado con ventilación e para os axentes 3 e 4 dispoñer de ventilación de aire. Cando no devandito edificio se leven a cabo outros procesos industriais, débese ter especial coidado en evitar a posible contaminación en caso de accidente. No caso do grupo 285

270 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS 2, só se necesitan asegurar unhas 10 renovacións hora para o confort das operacións do persoal. No caso de áreas de procesos deseñados para utilizar axentes do grupo 3, a ventilación debe estar asegurada instalando filtros HEPA nas saídas do aire e á entrada e saída para o grupo 4. O acceso ás áreas de traballo debe estar restrinxido para aqueles traballadores que teñan traballos específicos que realizar na área. Cando o risco proceda dun axente do grupo 4, a entrada farase a través de esclusas de presión negativa. O sinal de perigo biolóxico deberá estar presente no lado externo das portas onde se manexen axentes dos grupos 3 e 4. Nos lugares onde se manexen axentes do grupo 2 non hai necesidade específica de traballar con presión negativa, pero si onde se estean a manexar axentes 3 e 4. A presión diferencial será de 10 a 70 Pascais. Cando as actividades que implican risco biolóxico non se deban a procesos industriais, deberán aplicarse igualmente medidas de contención que impidan ou minimicen a liberación dos axentes potencialmente perigosos ao medio laboral, seguindo o anexo IV do Real decreto 664/1997. Entre outras medidas, os microorganismos deben de manipularse en lugares específicos dentro do edificio, separados fisicamente doutras áreas. Esta recomendación é aconsellable para os axentes pertencentes ao grupo 3 e esixible para os do grupo 4. O acceso ás áreas en que se manexan axentes biolóxicos estará restrinxido ao persoal designado. O aire extraído dos lugares de traballo en que se manexen axentes dos grupos 3 e 4 ha de ser filtrado a través de filtros de alta eficacia para partículas no aire (HEPA), para os axentes do grupo 4, tamén se filtrará o aire introducido. Segundo o axente de que se trate, pode ser aconsellable ou necesario manter unha presión negativa no lugar de traballo con respecto á presión atmosférica. Estableceranse procedementos específicos de desinfección para estas áreas. Ademais, 286

271 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS cando se manexen axentes dos grupos 3 e 4, o lugar de traballo deberá poder precintarse para permitir a súa desinfección. O control eficiente de vectores é outra medida importante para controlar os axentes que se transmiten coa participación daqueles. Cando os axentes cos que se traballa pertencen ao grupo 1, é suficiente con aplicar as boas prácticas de laboratorio e non se require ningún equipamento específico para un confinamento primario. O traballo lévase a cabo en bancos elevados abertos, cun sumidoiro como protección secundaria, as ventás han de estar pechadas para evitar correntes, o mobiliario será resistente e tanto o laboratorio como o mobiliario serán doados de limpar. Un medio importante para a prevención dos riscos biolóxicos por manipulación de material ou mostras de animais infectados é a utilización de cabinas de seguridade biolóxica. Estas son de diferentes tipos, en función dos tipos de axentes biolóxicos que se van manexar. CABINAS DE SEGURIDADE BIOLÓXICA As cabinas de seguridade biolóxica desenvolvéronse a partir das cabinas de fumes utilizadas nos laboratorios de química. Son cámaras de traballo que teñen como función protexer o traballador, pero que tamén serven para protexer o medio e o produto que se manexa. Para realizar eficazmente a súa función, estas cámaras van dotadas de filtros para purificar o aire. As cabinas de seguridade biolóxica van variar o seu deseño (colocación dos filtros, dos ventiladores, e das entradas e saídas de aire, así como a porcentaxe de aire recirculado) en función do grao de seguridade que se pretende alcanzar. Basicamente, distínguense tres tipos de cabinas de seguridade biolóxica: clase I, clase II e clase III. Dentro destas clases poden establecerse subclases (figura 14). 287

272 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Cabina de seguridade biolóxica tipo I: Este tipo de cabinas é apropiado para o traballo con axentes biolóxicos de baixo ou moderado risco. O aire que entra na cabina é aspirado directamente do laboratorio, sen filtración previa. Non se produce recirculación do aire, que é filtrado por filtros HEPA (filtros de alta eficacia para partículas no aire) antes da súa saída ao exterior. Para un funcionamento correcto, a velocidade de entrada de aire debe estar comprendida entre 0'4 e 1'0 m/s, con aberturas frontais non superiores a 20 cm, para evitar turbulencias. Este tipo de cabinas non prevé a exposición por contacto. Nestas cabinas o aire, previamente filtrado a través dun filtro HEPA, circula en sentido descendente (fluxo laminar vertical), protexendo, ademais de o traballador e o medio, os materiais manipulados. Tanto o aire recirculado como o que sae ao exterior son filtrados a través de filtros HEPA. O aire que provén do exterior forma unha barreira que impide a saída de aire pola abertura frontal. Esta cabina está recomendada para a manipulación de axentes biolóxicos de baixo ou moderado risco. Algúns autores inclúen os axentes clasificados no grupo 3. Tampouco preveñen a exposición por contacto. Segundo as súas características de deseño, porcentaxe de aire recirculado e dinámica de fluídos, hai diferentes tipos de cabinas de seguridade biolóxica de clase II: tipo A, tipo B1, Tipo B2 e tipo B3 (Lee e Johnson, 1997). Nas cabinas de clase II, tipo A recircúlase o 70% do aire, mentres que só se extrae o 30% restante. Como xa se indicou, as dúas correntes son filtradas a través de filtros HEPA. Na figura 14 pode verse a distribución de fluxos dentro da cabina. O aire que entra dende o local é aspirado na reixa frontal da cabina, sen alcanzar a área de traballo que, desta forma, permanece estéril. Dende a parte inferior ou posterior 288

273 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS da cabina un ventilador impulsa todo o aire ata a zona superior onde parte deste será recirculado. Para unha abertura frontal de 20 cm, a velocidade de entrada do aire recomendada é de aproximadamente 0'4 m/s. A velocidade do aire do fluxo laminar aconséllase que non sexa inferior a 0'4 m/s (Martí et alii, 1997). Figura 14.- Esquema de diferentes tipos de cabinas de seguridad biológica (de Arquer et alii, 2000) a) Clase I b) Clase II, tipo A c) Clase II, tipo B c) Clase III 289

274 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Cabina de seguridade biolóxica clase II: As cabinas de seguridade biolóxica clase II, tipo B1 recirculan unicamente o 30-50%-50 do aire, mentres que extraen un 50-70%-70. Nos dous casos o aire pasou a través de filtros HEPA. O aire limpo descende en fluxo laminar vertical sobre a área de traballo. A corrente de aire divídese na zona central, onde parte do aire se dirixe á reixa situada na parte posterior, por onde é extraído e conducido á zona de expulsión, e o resto do aire, xunto co que penetra dende o local pola abertura frontal, é filtrado e impulsado por un conduto separado ata a zona superior da cabina dende onde se reinicia o ciclo (figura 14). Este tipo de cabina dispón dun plenum separado para a corrente de aire recirculado non contaminado. A velocidade de entrada do aire, para unha abertura frontal de 20 cm, debe ser de 0'5 m/s, e a velocidade do aire do fluxo laminar descendente de 0,25 m/s (Martí et alii, 1997). Nas cabinas de clase II, tipo B2 non hai recirculación de aire dentro da cabina. Despois de filtrado a través de filtros HEPA, todo o aire é expulsado ao exterior. Estas cabinas utilízanse cando se traballa con axentes químicos tóxicos. O aire expulsado ha de recibir un tratamento suplementario axeitado aos produtos que se manexen. En canto aos axentes biolóxicos, ao igual que o resto das cabinas da clase II, utilízase para traballar cos de risco baixo ou moderado (grupos 1, 2 e, en casos, 3). Por último, a cabina de seguridade biolóxica clase II, tipo B3 é similar á de tipo A, cun plenum común para o aire de saída e o aire recirculado. O 70% do aire recirculado é expulsado ao exterior a través de filtros HEPA. Cabina de seguridade biolóxica clase III: Son cabinas hermeticamente seladas que separan completamente o traballador do axente biolóxico contaminante. As manipulacións dos materiais realízanse mediante as luvas que incorpora a cabina no seu panel central. O aire que se toma do local pasa por un filtro HEPA antes de entrar 290

275 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS na zona de traballo, non se recircula e vértese ao exterior logo da filtración a través de filtros HEPA. Esta cabina está recomendada para a manipulación de axentes biolóxicos extremadamente perigosos, dos grupos de risco 3 e 4. Estas cabinas son as que lle confiren a maior protección ao traballador, protexéndoo mesmo dos riscos por contacto. O INSHT (de Arquer et alii, 2000; Martí et alii, 1997) dá unha serie de recomendacións para o traballo con cabinas de seguridade biolóxica, co fin de garantir unha eficacia óptima. As devanditas recomendacións fan referencia á situación da cabina no laboratorio, aos procedementos de traballo, aos materiais e equipos para traballar no interior das cabinas, á utilización de equipos de protección individual, á realización de controis e mantemento e de operacións de limpeza e desinfección: Colocar as cabinas en cuartos nos que a actividade sexa escasa e afastadas de portas, ventás ou zonas nas que existan correntes de aire que puidesen crear turbulencias e perturbar o fluxo laminar. Colocar todo o material que se vaia utilizar na cabina antes de iniciar o traballo, procurando que a introdución de novo material sexa mínima. Evitar a introdución de focos de calor importantes na zona de traballo. Para a esterilización das asas de sementeira utilizaranse, preferentemente, microincineradores eléctricos ou asas de sementeira desbotables. Evitar introducir materiais sucios ou que liberen doadamente partículas, por exemplo, papel ou algodón. Evacuar os produtos de escoura en recipientes impermeables aptos para a súa esterilización. Realizar movementos lentos de brazos e mans no interior da cabina para non alterar a laminaridade do fluxo. 291

276 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Procurar que a zona de traballo estea situada entre 5 e 10 cm por enriba da base da cabina e a máis de 20 cm da abertura frontal, para evitar contaminacións producidas polo aire que choca contra a superficie ou o que penetra pola abertura frontal. Poñer a cabina en funcionamento entre 15 e 30 minutos antes de iniciar o traballo, e esperar un tempo prudencial logo de concluír o traballo para apagala. Evitar colocar obxectos entre o filtro HEPA e a área de traballo, xa que estes obxectos producirán zonas de turbulencias. O fluxo laminar non se reconstitúe ata unha distancia de 2,5 veces o diámetro do obxecto. Utilizar vestiario apropiado e limpo. Aconséllanse batas de manga longa, con bocamangas axustadas. Cando exista risco de contacto usaranse luvas de protección e recubriranse as mangas. Manter, en lugar visible, unha ficha de mantemento e control da cabina na que conste: o modelo e a referencia, a data de control, as horas de funcionamento, a presión de traballo, a velocidade do aire, o test DOP, a data de substitución do filtro HEPA e a data da próxima revisión. Realizar as operacións de limpeza e desinfección antes de iniciar o traballo e ao finalizar este e, ademais, nos seguintes casos: cando se produzan derramamentos na superficie de traballo, sempre que se cambie o programa de traballo, antes de realizar un test de control e antes de calquera traballo de mantemento rutineiro ou accidental da cabina. Realizar a descontaminación das zonas inaccesibles e contaminadas (ventiladores, plenos, filtros) mediante esterilización gasosa. Un método posible consiste na despolimerización de paraformaldehido por quentamento. Este método debe aplicarse antes de traballos de mantemento, antes do cambio dos filtros, antes de realizar os 292

277 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS tests básicos de control, antes do traslado da cabina e antes de cambiar o programa de traballo. PRECAUCIÓNS DE CARÁCTER UNIVERSAL Naquelas actividades laborais, como as de asistencia sanitaria, veterinaria ou os laboratorios de análises clínicas, nas que existe unha incerteza sobre a presenza de axentes perigosos para a saúde han de tomarse unha serie de precaucións de carácter universal (de Arquer, 2000). As precaucións universais comprenden unha serie de recomendacións no que se refire ao trato e manexo dos pacientes, das mostras e dos materiais, destinadas a evitar os problemas causados por estes axentes, supoñendo que poden conter patóxenos transmitidos polo sangue ou outros fluídos biolóxicos como seme, secrecións vaxinais, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, líquido pleural, líquido peritoneal, líquido pericárdico e líquido amniótico. Estas recomendacións desenvolvéronse, fundamentalmente, para previr os contaxios provocados, entre o persoal sanitario e o que traballa en laboratorios de diagnóstico, polo virus da inmunodeficiencia humana (VIH) e o virus da hepatite B. Partindo do suposto de que a exposición aos fluídos corporais constitúe o principal determinante do risco de infección ocupacional, engádese o concepto da universalidade do risco, o que significa que debe asumirse que todos os pacientes son potencialmente infecciosos. Non se establecen prácticas de traballo diferentes para aqueles pacientes que se considera que poden padecer unha determinada enfermidade infecciosa fronte a aqueloutros que non se sospeita que estean afectados polas devanditas enfermidades. En xeral, dende este punto de vista, non falaremos de pacientes de risco, senón de prácticas de risco. As guías refírense ás prácticas de traballo, á utilización de equipos protección, ás prácticas de limpeza, desinfección e descontaminación, e ao manexo e depósito das agullas e obxectos punzantes. Os traballadores deberían usar de forma rutineira elementos de protección cando, nas operacións que realicen, exista a posibilidade de contacto co sangue ou 293

278 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS fluídos corporais: luvas, cando se vaian realizar manipulacións do sangue, fluídos, mucosas, feridas ou obxectos contaminados; máscaras e protectores oculares, cando se poida producir aerosolización do sangue ou fluídos biolóxicos; e roupa de protección, cando se poidan producir salpicaduras. Nunca se pipeteará coa boca. Deben de extremarse as medidas de hixiene persoal, como o lavado das mans, con auga e xabón líquido, ao comezar e ao rematar a xornada, e despois de realizar calquera técnica. En circunstancias especiais empregaranse substancias antimicrobianas. Para o secado das mans utilizaranse toallas de papel desbotables. As feridas e lesións das mans deben protexerse cun apósito impermeable antes de empezar a traballar. Está prohibido comer, beber, fumar, comer goma de mascar ou maquillarse na área de traballo. Para previr accidentes por cortes ou picaduras con materiais como agullas, escalpelos, etc., estes instrumentos deben manipularse coas máximas precaucións e, para eliminalos, depositaranse, sen encapsular, en recipientes ríxidos e impermeables axeitados, situados nas proximidades da área de traballo. Algúns estudos (Roy e Robillard, 1994) poñen de manifesto que o nivel de cumprimento destas precaucións universais é moi variable. Así, mentres que o cumprimento de prácticas como non pipetear coa boca (97%) ou o manexo seguro das xiringas (72%) son seguidos por unha elevada porcentaxe de profesionais, outras como lavar as mans (28%) ou a utilización de luvas (35%), teñen un seguimento moito menor. Tamén se apreciou que o grao de cumprimento varía coa profesión, o tipo de pacientes e o tipo de procedemento. Por exemplo, os médicos usan luvas en menor medida que as enfermeiras, e os que tratan a nenos utilizan menos os elementos de protección que os que tratan a adultos. No caso de traballar con determinados axentes pertencentes ao grupo 2, pode ser necesario establecer unha serie de medidas complementarias ás que establece o nivel de contención 2 do anexo IV do Real decreto 664/1997. O traballo 294

279 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS con estes axentes poderíase realizar directamente sobre o banco de probas ou mesa de traballo, procurando reducir ao máximo a produción de bioaerosois. Non obstante, naqueles casos en que poidan producirse bioaerosois infectivos, o material infectado manexarase en cabinas de seguridade biolóxica ou illantes. Este é o caso de traballar con axentes infecciosos a través do aire: Chlamydia trachomatis, Clostridium botulinum, Cryptococcus neoformans, Legionella pneumophila ou Neisseria meningitidis. Ademais é recomendable a utilización de luvas ao manexar estes axentes, pois algúns deles son infectivos a través da pel ou de mucosas, en doses baixas. EQUIPOS E PRENDAS DE PROTECCIÓN INDIVIDUAL Seguindo o Real decreto 773/1997, sobre disposicións mínimas de seguridade e saúde relativas á utilización polos traballadores dos equipos de protección individual, considérase como equipo de protección persoal calquera equipo destinado a ser levado ou suxeitado polo traballador para que o protexa dun ou de varios riscos que poden ameazar a súa seguridade ou saúde, así como calquera complemento ou accesorio destinado para tal fin. Os equipos de protección individual (EPI) utilizaranse cando os riscos non se poidan evitar ou non poidan limitarse suficientemente por medios técnicos de protección colectiva ou mediante medidas, métodos ou procedementos de organización do traballo. Os equipos de protección individual proporcionarán unha protección eficaz fronte aos riscos que motivan o seu uso, sen supoñer por si mesmos ou ocasionar riscos adicionais nin molestias innecesarias. Para tal fin deberán: a) Responder ás condicións existentes no lugar de traballo. b) Ter en conta as condicións anatómicas e biolóxicas e o estado de saúde do traballador. c) Axeitarse ao portador, logo dos axustes necesarios. En calquera caso, os equipos de protección individual que se utilicen deberán reunir os requisitos establecidos en 295

280 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS calquera disposición legal ou regulamentaria que sexa de aplicación, en particular no relativo ao seu deseño ou fabricación. O Real decreto 773/1997 dá indicacións que serven de guía para a selección e avaliación dos EPI. Os equipos de protección individual clasifícanse atendendo á parte do corpo que protexen. Así, os destinados a protexer contra os axentes biolóxicos poden dividirse nos seguintes grupos: 1. Protección respiratoria 2. Protectores da cabeza, dos ollos e da cara 3. Protección dos brazos e das mans 4. Protección do tronco 5. Protección dos pés e das piernas A protección respiratoria ten como obxectivo previr a inhalación de bioaerosois. Estes equipos poden ser dependentes do medio (máscaras ou máscaras cun filtro axeitado) ou, naqueles laboratorios que experimenten con axentes clasificados no grupo 4, independentes do medio, con traxes illantes cun equipo de protección individual respiratoria con introdución de aire a presión positiva. De entre os filtros de que existen actualmente no mercado, os clasificados como P 3 (alta eficacia fronte a partículas sólidas e aerosois líquidos) son os que se poden recomendar para protexer fronte a microorganismos. Esta afirmación non está, non obstante, contemplada especificamente no campo de aplicación das normas EN-143 e EN-149. Hai que facer notar que só os filtros absolutos, HEPA, protexen completamente contra os riscos biolóxicos. As máscaras cirúrxicas, malia poder protexer fronte aos riscos biolóxicos derivados de salpicaduras de auga contaminada, de sangue ou doutros fluídos corporais ás mucosas oral ou nasal, non se consideran equipo de protección persoal. En canto á protección da cabeza, dos ollos e da cara, esta aplicarase cando existe risco de que se produzan proxeccións e salpicaduras que poden alcanzar o rostro. Estas proteccións 296

281 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS poden circunscribirse unicamente aos ollos cando o que se quere protexer é a mucosa ocular. Falamos entón de lentes de protección, que poden ser de varios tipos, pero que han de protexer o ollo en calquera dirección. Se, ademais, se quere protexer toda a cara, entón débense empregar pantallas, viseiras faciais ou, en determinados casos, un capuz que recubra completamente a cabeza. O manexo de substancias ou materiais que poden estar contaminados con axentes biolóxicos ha de realizarse coas debidas proteccións das mans e dos brazos. Estas proteccións han de evitar que a pel entre en contacto coas substancias contaminantes, especialmente salpicaduras de fluídos biolóxicos ou líquidos contaminados, pero tamén han de protexer contra os obxectos cortantes e punzantes potencialmente contaminados. Na actualidade non existen luvas específicas fronte ao risco biolóxico, pero considérase que as luvas que protexen contra a penetración da auga e do aire e que se ensaian segundo a norma UNE-EN protexen contra os microorganismos. Normalmente empréganse luvas dun só uso que, ademais, deben substituírse cando se cambie de actividade ou cando teña lugar unha salpicadura, rotura ou perforación. En determinadas actividades, ademais da roupa de traballo (batas e uniformes), pode ser necesario a utilización de mandís ou mandís impermeables que protexan o corpo dun modo máis eficiente. Por último, tamén se pode recorrer ás botas e polainas para protexer os pés e as pernas. Pode obterse máis información sobre equipos de protección individual ou sobre a súa xestión nas notas técnicas de prevención número 571 e 572 do INSHT (Martí et alii, 2000 a e Martí et alii, 2000b). 297

282 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS VACINACIÓN A vacinación é unha inmunización preventiva que se aplica sobre o receptor. Consiste en lle administrar á persoa potencialmente exposta unha suspensión de axentes específicos, ou dalgún compoñente deles, co fin de establecer resistencia a unha enfermidade infecciosa. A eficacia da resposta inmunolóxica depende de varios factores como son a composición e dose de antíxeno, o modo de administrar a vacina, os adxuvantes utilizados para potenciar a resposta inmunitaria e o propio estado inmunitario do receptor. Son numerosos os procedementos de inmunización que incrementan a resistencia aos axentes infecciosos. Así, pode utilizarse o propio axente infeccioso atenuado, como no caso dos virus que producen a varíola, o sarampelo, a parotidite, a rubéola, a poliomielite ou as micobacterias produtoras da tuberculose (bacilo de Calmette-Guérin ou cepa BCG); o axente inactivado como nos virus da rabia, a influenza ou a poliomielite; o axente morto como as bacterias que ocasionan a febres tifoideas e paratifoideas (Salmonella spp.), a tose ferina (Bordetella pertussis) ou a rickettsia causante da febre tifoidea (R. prowazeki); fraccións antixénicas (Yersinia pestis) ou os seus produtos como toxoides (difteria e tétano), cando son aqueles os responsables principais do efecto patóxeno, ou polisacáridos capsulares (Neisseria meningitidis). A vacina debe ter unha forte capacidade antixénica que provoque unha resposta protectora mediante a estimulación da produción de anticorpos e/ou a activación das células inmunocompetentes. Así mesmo, a vacina debe xerar memoria inmunolóxica para o que, nalgúns casos, pode ser necesario administrar periodicamente dose de recordo para conseguir que a resposta inmune sexa duradeira. A inmunoxenicidade das proteínas solubles increméntase coa súa persistencia nos tecidos, así, a resposta inmunitaria que se consegue nun individuo é maior cando se administra unha dose repartida en repetidas ocasións que cando esa 298

283 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS mesma dose se administra dunha soa vez. Para conseguir un efecto duradeiro, os inmunóxenos adoitan administrarse adsorbidos en xeles inorgánicos (ilumine, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio), o cal ten por misión liberar o antíxeno lentamente durante un período prolongado. A vía de administración (oral, inxección cutánea ou intramuscular) e a zona do corpo tamén van influír sobre a resposta inmune. A elección do lugar de inxección do antíxeno determínase por conveniencia, pois a inmunidade débese ás moléculas diseminadas de forma xeral. Non obstante, en determinados casos, a activación preferente de determinados grupos de células que se localizan nos puntos de entrada dos organismos pode ser moi valiosa. Así, por exemplo, a vacina antipolio atenuada administrada por vía oral parece ser máis efectiva que cando se inxecta. Na administración de vacinas hai que ter en conta que existen situacións nas que pode haber un incremento do risco de reaccións adversas ou unha diminución da eficacia das vacinas. De modo xeral, a vacinación está contraindicada cando o suxeito padece unha enfermidade infecciosa febril aguda ou se atopa no período de convalecencia, ou cando existe algunha enfermidade crónica non tratada como a tuberculose. A vacinación tamén pode estar contraindicada no caso de enfermidades sistémicas crónicas (cardíacas, renais, diabete, etc.). Determinadas vacinas, como consecuencia do sistema de obtención ou das substancias engadidas (conservantes, antibióticos), poden conter substancias capaces de provocar reaccións alérxicas en individuos susceptibles, e o seu uso estará contraindicado nestes casos. Nos casos de inmunodeficiencia, ben sexa conxénita ou adquirida, pode suceder que, como consecuencia da administración de vacinas fabricadas con axentes atenuados, estes axentes se multipliquen de forma incontrolada ocasionando unha enfermidade. A OMS (2003) recomenda que o persoal que traballa nos laboratorios se vacine contra as seguinte enfermidades: 299

284 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS difteria, hepatite B, sarampelo, papeiras, poliomielite, rubéola, tétanos, tuberculose e febre tifoidea. Así mesmo, a todas as persoas que manexen ou que traballen con animais infectados cos axentes que se relacionan a continuación, subministraráselles a vacina ou o toxoide axeitados: Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Francisella tularensis tipo A, Haemophilus influenzae, virus da encefalite xaponesa B, Mycobacterium leprae, Neisseria meningitidis, Yersinia pestis, virus da hepatite A, virus da influenza, virus da rabia, virus da febre do val do Rift, virus da encefalite por carrachas, virus varíola-zoster, virus da encefalomielite equina venezolana, virus da febre amarela. A vacina contra o virus da Vaccinia está recomendada para aquelas persoas que traballan con poxvirus. Existen ademais outras vacinas que poden ser indicadas en circunstancias específicas para traballadores de laboratorio de alto risco. 300

285 CONTROL DOS CONTAMINANTES BIOLÓXICOS Axentes para os que existe unha vacina eficaz dispoñible (Anexo II do R.D. 664/1997) VIRUS BACTERIAS E AFÍNS Virus da febre do val Rift Bordetella pertusis Virus da encefalite das Clostridium tetani (1) carrachas de Europa Central Corynebacterium diphtheriae (1) Virus da Encefalite B xaponesa Mycobacterium africanum Virus do Bosque de Kyasamur Mycobacterium bovis Virus Omsk Mycobacterium tuberculosis Virus da encefalite verno-estival rusa Neisseria meningitidis Virus da febre amarela Salmonella paratyphi A, B, C Virus da hepatite B (1) Salmonella typhi Virus da hepatite D (Delta) Yersinia pestis Virus da influenza tipos A, B e C Virus do sarampelo (1) Virus das papeiras (1) Virus da hepatite A (1) Poliovirus Virus Monkeypox Virus da variola Virus Whitepox Virus da rabia Virus da encefalomietise equina americana oriental Virus da encefalomietise equina venezuelana Virus da encefalomietise equina americana occidental Rubivirus (2) (1) vacinas máis recomendadas para traballadores expostos a estes axentes biolóxicos. (2) recomendada para o persoal feminino seronegativo en idade fértil con probable exposición ao axente. 301

286 REQUIRIMENTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN

287 REQUIRIMINTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN O artigo 15 do Real decreto 664/1977 establece que os laboratorios que emprendan traballos que impliquen a manipulación de axentes biolóxicos dos grupos 2, 3 ou 4 con fins de investigación, desenvolvemento, ensino ou diagnóstico deberán establecer medidas de contención de conformidade co anexo IV deste real decreto, co fin de reducir ao mínimo o risco de infección. Atendendo ao risco relativo que entrañan os microorganismos que neles se manipulan, os laboratorios clasifícanse en catro niveis de seguridade biolóxica, niveis de contención biolóxica 1, 2, 3 e 4, para traballar, respectivamente, con axentes biolóxicos pertencentes aos grupos de risco 1, 2, 3 e 4. No Manual de bioseguridade da OMS (OMS, 2003) e na Guía técnica para a avaliación e prevención dos riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos (INSHT, 2003) resúmense as características, en canto a estrutura, equipos de protección (contención) e normas de traballo (técnicas de laboratorio), que se han de aplicar a cada tipo de laboratorio. As medidas indicadas para un nivel inferior aplicaranse tamén nos niveis de seguridade superiores, salvo que sexan substituídas por outras máis esixentes. LABORATORIOS DE NIVEL DE CONTENCIÓN BIOLÓXICA 1. LABORATORIO BÁSICO Os laboratorios de nivel de contención biolóxica 1 non están directamente contemplados polo Real decreto 664/1997. Neles trabállase con axentes biolóxicos que é pouco probable que lle causen enfermidade ao traballador. Aínda que algunhas das precaucións que se indican a continuación poidan parecer innecesarias tendo en conta o grupo de risco co que traballamos, non o son en tanto en canto é necesario promover as boas prácticas microbiolóxicas, en xeral, e as que se refiren á seguridade, en particular. Prácticas de laboratorio As portas de acceso ao laboratorio deben manterse pechadas. 305

288 REQUIRIMENTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN O acceso ao laboratorio estará limitado cando os experimentos estean en marcha e o responsable do laboratorio o considere necesario. As superficies onde se traballa deben ser descontaminadas unha vez ao día e despois do derramamento de calquera material infeccioso. Estará estritamente prohibido pipetear coa boca. Non deben colocarse materiais na boca. As etiquetas non deben ser lambidas. Non está permitido comer, beber, fumar, maquillarse ou manexar lentes de contacto no laboratorio. A comida almacenarase en armarios ou refrixeradores destinados para tal fin e situados fóra da zona de traballo. Antes de abandonar o laboratorio, o persoal que manexase materiais ou animais infecciosos debe lavar as mans. O uso de luvas será obrigatorio en todos os traballos que entrañen risco de contacto directo ou accidental con sangue, material infeccioso ou animais infectados. Despois do seu uso, retirarán as luvas e lavarán as mans. As mans hanse de lavar despois do manexo de materiais ou animais infecciosos e antes de deixar as áreas de traballo do laboratorio. Sempre que haxa perigo de salpicaduras utilizaranse lentes de seguridade, pantallas faciais ou outros dispositivos de protección. Calquera técnica ou manipulación debe ser efectuada de maneira que minimice a creación de aerosois. Débense utilizar procedementos que minimicen a formación de aerosois. Se hai risco de aerosolización, os traballos deben realizarse en cabina de seguridade biolóxica. Recoméndase o emprego de batas ou outro tipo de equipamento que preveña a contaminación da roupa de rúa. Estará prohibido utilizar a roupa de laboratorio fóra deste. A roupa de laboratorio non se almacenará no mesmo lugar que a roupa de rúa. 306

289 REQUIRIMINTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN Prácticas especiais Os materiais contaminados iranse depositando en colectores apropiados, identificados axeitadamente, que se pecharán para o seu traslado. Debe existir unha programa de desinsectación e desratización. Na área de traballo non se permitirá a presenza de animais non relacionados co traballo en marcha. Equipo de seguridade Normalmente non é necesario. Instalacións Ao deseñar un laboratorio hai que lles prestar unha atención especial aos factores que poden xerar problemas. Entre eles figuran a xeración de aerosois, traballos con grandes cantidades de microorganismos, laboratorios ateigados tanto de persoal como de material, a infestación por roedores ou insectos ou a entrada de persoas non autorizadas. A continuación danse unha serie de recomendacións xerais que debe seguir o deseño das instalacións dun laboratorio, sexa cal sexa o seu nivel de contención. O laboratorio estará deseñado para que a súa limpeza resulte cómoda e accesible. Os teitos, paredes e chans serán resistentes á acción das substancias químicas e produtos desinfectantes de uso ordinario. As superficies de traballo serán impermeables e resistentes a ácidos, álcalis, disolventes orgánicos e calor moderada. O mobiliario será robusto. O espazo entre mesas, estantes, armarios, cabinas e outros equipos será suficiente para permitir a doada limpeza do laboratorio e un movemento cómodo dos traballadores. Instalarase unha iluminación axeitada e suficiente para todas as actividades que se realicen. Evitarase que se produzan reflexos. O nivel recomendado para o traballo no laboratorio é de 500 lux. O laboratorio disporá dun espazo de almacenamento para as subministracións de uso inmediato, no que se 307

290 REQUIRIMENTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN evitará a desorde. Os produtos de uso a longo prazo almacenaranse nun espazo localizado fóra das zonas de traballo do laboratorio. As portas deben estar protexidas contra incendios e pecharse automaticamente. Estarán provistas de axexadoiros de porta con cristal de seguridade de 40 x 23 cm situado á altura da mirada. A súa misión é evitar accidentes e poder examinar o interior do laboratorio sen abrir a porta. Deben existir medios de protección contra incendios, para evitar que se inicie o incendio e para impedir que se propague. Tamén debe haber un sistema de detección de fumes con alarma acústica e óptica. O laboratorio estará provisto dun lavabo para lavar as mans. Se o laboratorio dispuxese de ventás que se puidesen abrir, estas levarán protección fronte á entrada de insectos. LABORATORIOS DE NIVEL DE CONTENCIÓN BIOLÓXICA 2. Aplicaranse as recomendacións descritas para o laboratorio básico, engadindo as especiais para a instalación dun laboratorio de contención biolóxica 2 e que se citan a continuación: Prácticas especiais O responsable de seguridade e hixiene do laboratorio poderá limitar ou restrinxir o acceso a este cando o traballo estea en marcha. Deste xeito, persoas con risco de adquirir infeccións ou para as que unha infección poida resultar especialmente perigosa non terán permitida a entrada ao laboratorio. Cando os axentes infecciosos que se manexen requiran o emprego de medidas de seguridade adicionais (por exemplo, estar vacinado) na porta de acceso ao laboratorio deberá colocarse un cartel que o indique claramente, xunto co símbolo de perigo ou risco biolóxico. Tamén deben sinalizarse os conxeladores e refrixeradores utilizados para gardar microorganismos do grupo de risco 2 co mesmo símbolo. 308

291 REQUIRIMINTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN Todos os residuos do laboratorio, tanto líquidos como sólidos, deben ser descontaminados axeitadamente antes da súa eliminación. Os que teñan que ser descontaminados fóra do laboratorio depositaranse en colectores apropiados que se pecharán antes de ser trasladados do laboratorio. O uso das agullas hipodérmicas e xiringas limitarase á inoculación parenteral ou extracción de fluídos dos animais ou de colectores con diafragma. Nunca se utilizarán como substituto das pipetas. Será necesario prestar atención especial á autoinoculación e á creación de aerosois. As agullas e xiringas desbotaranse sen reencapsular en colectores ríxidos, destinados para tal fin, que se descontaminarán en autoclave antes da súa eliminación. Os derramamentos e outros accidentes que teñan como consecuencia a sobreexposición do persoal a materiais infectados deberanlle ser comunicados ao responsable de seguridade e hixiene. Manterase un rexistro de todos os accidentes e incidentes. Equipos de seguridade Instalacións Cabinas de seguridade de clase I ou II ou outros sistemas de protección física do persoal (lentes de seguridade, máscaras ou outros dispositivos de protección) que se empregarán cando se leven a cabo técnicas cun alto risco de formación de aerosois ou se utilicen grandes volumes ou altas concentracións de axentes infecciosos. O laboratorio onde se manipulen os axentes biolóxicos estará separado do corredor de circulación por un vestíbulo. Este serviralles aos usuarios para cambiar a roupa de traballo, xa que ten que ser distinta á habitual. Será necesario que haxa unha autoclave no mesmo laboratorio para a descontaminación de escouras e de material biolóxico contaminado. 309

292 REQUIRIMENTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN Se o aire do laboratorio é renovado regularmente, a achega de aire novo será, como mínimo, de 60 m 3 por persoa e hora. As ventás estarán hermeticamente pechadas. Cada laboratorio contará cun lavabo para lavar as mans. Este deberá funcionar preferentemente co cóbado ou co pé. Ten que haber unha sala de repouso para o persoal. LABORATORIOS DE NIVEL DE CONTENCIÓN BIOLÓXICA 3. Aplicaranse as recomendacións descritas para o laboratorio de contención biolóxica 2, engadindo as especiais para a instalación dun laboratorio de contención biolóxica 3 e que se citan a continuación: Prácticas especiais Aplicarase a regra de traballo por parellas segundo a cal ningún individuo traballará só no laboratorio. O responsable de seguridade e hixiene do laboratorio será quen controle o acceso a este e quen restrinxa, ao seu criterio, a entrada daquelas persoas das que se requira a súa presenza por razóns alleas ao traballo que se realiza (persoal de mantemento, visitantes...). O responsable do laboratorio debe establecer as regras e os procedementos segundo os cales se autorizará o acceso ao laboratorio. A lista das persoas autorizadas estará colgada na porta de acceso ao nivel de contención biolóxica 3. Na porta de acceso ao laboratorio de nivel 3 de contención biolóxica, ademais de colocar o sinal internacional de perigo biolóxico, hai que identificar o axente biolóxico, mencionar o nome do director do laboratorio e da persoa que o substitúa, e indicar calquera condición especial imposta aos que entren nesta área, por exemplo, a necesidade de inmunización. As persoas cun alto risco de contraer infeccións ou para as que estas poidan resultar especialmente perigosas teñen prohibida a entrada. As superficies de traballo das cabinas e doutros equipos de seguridade descontaminaranse unha vez que o traballo co material infectado conclúa. Pode ser de utilidade o 310

293 REQUIRIMINTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN emprego de materiais desbotables especiais para cubrir determinadas superficies. En principio, o número de persoas presentes no laboratorio non será nunca superior á de cabinas de seguridade biolóxica. Calquera accidente con exposición a axentes infecciosos debe serlle inmediatamente notificado ao responsable do laboratorio e ao servizo de prevención. Todo o material de refugallo debe ser descontaminado antes da súa eliminación. As tomas de baleiro deberán estar protexidas con filtros HEPA e os sifóns deberán descontaminarse. De todo o persoal que traballe no laboratorio deberase facer unha toma anual de sangue ou coa periodicidade que o requira o tipo de traballo que se realice. Disporase dun Manual de seguridade biolóxica. Equipos de seguridade Instalacións En todas as actividades que impliquen manexo de material infectado con perigo de produción de aerosois se deberán empregar cabinas de seguridade biolóxica dos tipos I, II ou III. Estas utilizaranse para todos os traballos e actividades que poidan provocar calquera risco de exposición aos aerosois infecciosos. Se non é posible o emprego de cabinas de seguridade biolóxica, estudaranse sistemas de protección segundo os principios básicos de hixiene e seguridade. O laboratorio deberá estar separado das zonas onde non exista restrición á entrada de persoal. É conveniente que o acceso a este dende os corredores e outras zonas contiguas se realice a través dun dobre porta. A separación do laboratorio do resto de instalacións tamén pode efectuarse mediante salas como vestiarios que conteñan duchas, esclusas... Debe haber un sistema de ventilación que produza unha presión negativa dentro do laboratorio, de maneira que se estableza unha corrente de aire que vaia dende o 311

294 REQUIRIMENTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN corredor ou o laboratorio básico ata a zona de contención. O aire debe circular sempre do lugar menos contaminado ao máis contaminado. O sistema de aire acondicionado do edificio debe estar deseñado de modo que non se produza recirculación do aire do laboratorio de contención a outras áreas do edificio. O aire que saia do laboratorio debe descargarse ao exterior filtrado a través de filtros de alta eficacia para partículas (HEPA). As cabinas de seguridade biolóxica situaranse separadas das zonas de paso e fóra da influencia das correntes das portas e do sistema de ventilación. Preto da porta de saída disporase dun lavabo automático ou accionado por pedal ou co cóbado. As ventás permanecerán sempre pechadas, seladas e con cristais irrompibles. As portas de acceso ao laboratorio terán peche automático e con fecho, aínda que dende o interior sexan de doada apertura. Neste tipo de laboratorio non haberá nin conexión ao gas da rede, nin ao sistema de baleiro centralizado. LABORATORIOS DE NIVEL DE CONTENCIÓN BIOLÓXICA 4. LABORATORIO DE CONTENCIÓN MÁXIMA. Os laboratorios de nivel de contención 4, tamén chamados de contención máxima, requírense cando se traballa con axentes biolóxicos do grupo 4. Antes de construír e poñer en funcionamento un laboratorio de contención máxima requírese un labor de investigación e consulta con institucións que adquiriran experiencia con laboratorios deste tipo. Os laboratorios de contención máxima deben estar supervisados polas autoridades sanitarias. Prácticas especiais Os materiais biolóxicos que teñan que saír do laboratorio de nivel 4 de contención ou das cabinas de clase III farano nun colector irrompible, que irá, pola súa vez, dentro dun segundo colector hermético e de doada descontaminación. Para permitir a saída deste material, o 312

295 REQUIRIMINTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN segundo colector pasarase por un produto descontaminante. Ningún material, agás o biolóxico que debe permanecer intacto, sairá do laboratorio sen ser descontaminado en autoclave. O equipo ou material que poida resultar danado polas condicións da esterilización descontaminarase de xeito similar a como se fai co biolóxico. Nunha nota clara e á vista, especificaranse o desinfectante que se debe utilizar, a concentración e o tempo de contacto. Só as persoas expresamente autorizadas para iso terán acceso ao laboratorio. E deberán facelo a través dun vestiario con ducha de seguridade. Os traballadores ducharanse cada vez que abandonen o laboratorio. Prohibiráselles a entrada ás persoas con alto risco de contraer infeccións ou para as que estas poidan ser particularmente perigosas. Por outro lado, a entrada ao laboratorio estará limitada mediante medidas de seguridade adicionais. O persoal que entra no laboratorio só poderá saír a través dun vestiario con ducha e deberá ducharse obrigatoriamente cada vez que abandone o laboratorio. A roupa de rúa deixarase no vestiario e cambiarase por outra de uso exclusivo para o laboratorio de nivel 4. Cando se vaia saír do laboratorio, esta roupa introducirase nunha caixa hermética de transporte que se descontaminará antes de ser levada ao exterior. O símbolo universal de perigo biolóxico estará situado na porta de entrada. Nos casos necesarios, indicarase ademais o tipo de axente biolóxico que se manexa, así como a identificación e modo de localización do responsable de seguridade e hixiene, así como a necesidade de empregar determinados equipos de seguridade adicionais. A subministración de materiais realizarase a través dunha autoclave de dobre porta, esclusa ou cámara de descontaminación superficial. No laboratorio están totalmente prohibidos os materiais, como plantas, animais, roupa non relacionados co experimento. O descrito anteriormente para outros niveis en canto ao uso de xiringa e agullas hipodérmicas, é aplicable neste 313

296 REQUIRIMENTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN caso, coa salvidade de que sempre que a técnica o permita, se preferirán cánulas a agullas. Equipos de seguridade Todas as manipulacións que se leven a cabo no laboratorio se efectuarán en cabinas de clase III ou en cabinas de clase II en combinación con traxes autónomos de respiración asistida e presión positiva no interior. Instalacións Un laboratorio de máxima seguridade ou de nivel de contención 4 pode considerarse tanto como unha instalación independente como parte dunha zona claramente demarcada dentro do edificio xeral. Requírense vestiario de entrada e saída con duchas. Para aqueles materiais que non poidan pasar a través dos vestiarios, é imprescindible contar cunha autoclave con dobre porta, ou unha esclusa ou cámara de descontaminación superficial. As paredes, teitos e chans estarán construídos de maneira que formen unha cámara selada que facilite a descontaminación por vaporización e impida a entrada de insectos ou roedores. As superficies internas desta cámara serán resistentes aos produtos químicos, de xeito que sexa posible a limpeza e descontaminación pola vía máis conveniente para cada caso. Evitaranse as xuntas nas mesas de traballo e as súas superficies serán impermeables e resistentes a ácidos, álcalis, disolventes orgánicos e calor moderada. Todos os desaugadoiros estarán conectados directamente co sistema de descontaminación de escouras. Os efluentes das pías de lavado, cabinas de seguridade, chans e autoclaves descontaminaranse por un tratamento químico ou por calor antes de saír do laboratorio. O laboratorio de nivel 4 de seguridade biolóxica terá un sistema de ventilación propio que o manterá en depresión. A saída do aire estará separada de tomas de aire e de lugares habitados, e realizarase a través de filtros HEPA, que se situarán o máis preto posible do laboratorio co fin de reducir ao máximo a contaminación das conducións. 314

297 REQUIRIMINTOS DOS LABORATORIOS SEGUNDO O SEU NIVEL DE CONTENCIÓN Se existe un sistema centralizado de baleiro debe selo a través de filtros HEPA; outros servizos que se subministran ao laboratorio, tanto de líquidos coma de gases estarán protexidos por un dispositivo que evite o refluxo. A entrada e saída do aire será individualizada do resto do edificio. As portas de acceso serán de peche automático e coa posibilidade de ser pechadas con chave. Para pasar materiais dentro do laboratorio existirá unha autoclave de dobre porta, esclusa ou cámara de descontaminación superficial. A porta da autoclave que dá á parte exterior do laboratorio estará controlada automaticamente, de maneira que só se poida abrir cando o ciclo de esterilización finalice. Para os equipos que non poidan ser introducidos na autoclave, existirá un colector con líquido descontaminante ou algún sistema similar. Tamén se pode traballar con cabinas de tipo I e II se se subministra un traxe especial, feito dunha soa peza, con presión positiva no seu interior e respiración asistida. Inclúe alarmas e bombonas de osíxeno de urxencia. A entrada ao laboratorio farase a través dunha esclusa. Antes de abandonar por completo a zona, o persoal que leve este tipo de traxe tomará, para a súa descontaminación, unha ducha química. 315

298 CASOS PRÁCTICOS (EXEMPLOS DE MOSTRAXE DE AXENTES BIOLÓXICOS TOMADOS DA BIBLIOGRAFIA)

299 CASOS PRÁCTICOS. EXEMPLOS DE MOSTRAXE DOS AXENTES BIOLÓXICOS TOMADOS DA BIBLIOGRAFÍA Coa fin de dar unha orientación sobre a elección do sistema de toma de mostra, así como dos métodos de análise, seleccionamos algúns traballos de recente publicación. Destes traballos destacamos os sistemas de toma de mostra, a análise e os valores atopados, dado que son indicativos da súa aplicabilidade a problemas ambientais. BACTERIAS, FUNGOS E ENDOTOXINAS EN GRANXAS DE PORCOS Caroline Duchoine et alii (2000 a) estudaron a influencia que aspectos como o mantemento do edificio, factores ambientais e a variación estacional exercen sobre os niveis de contaminantes biolóxicos e químicos en granxas de porcos. Deste traballo interésanos destacar que se estudou a contaminación fúnxica, bacteriana e por endotoxinas. A continuación indicamos os sistemas de mostraxe e análises utilizadas, así como os principais resultados obtidos. Os lugares máis representativos do ambiente da granxa seleccionáronse visualmente. As mostras tomáronse nun período de 4 horas, a razón de tres mostras por cada período (ao principio, na metade e ao final das 4 horas). Bacterias. Para mostrar as bacterias utilizouse un burbullador no medio líquido (AGI-30) conectado a unha bomba que funcionaba a un caudal de 12'5 litro/min. durante 16 minutos. O impinger contiña 20 ml dunha solución salina (0'08% NaCl) e mantense en xeo despois da mostraxe. Previamente á análise, no laboratorio, mídese o volume de líquido (para valorar a evaporación), e complétase o volume ata 30 ml con disolución salina que contén 0'15% Tween 80. Para a cuantificación das bacterias, sementáronse por triplicado mostras diluídas e sen diluír. O medio de cultivo elixido foi Triticase soia ágar (TSA) con 500 mg/litro de cicloheximida para evitar o crecemento de mofos. As placas incubáronse a 30º C durante 60 h. O reconto de bacterias levouse a cabo naquelas placas cun número de colonias que estaba comprendido entre 30 e 300. Como control utilizáronse mostras procedentes do exterior da granxa (estes valores restáronselle aos do interior). 319

300 CASOS PRÁCTICOS. EXEMPLOS DE MOSTRAXE DOS AXENTES BIOLÓXICOS TOMADOS DA BIBLIOGRAFÍA Os resultados poñen de manifesto que a presenza de bacterias é maior no inverno, con 4'25 x 105 UFC/m3 (1'67 x 10 5 a 9'30 x 10 5 UFC/m3) de bacterias totais. Non obstante, a pesar de ser máis baixos, os valores observados en verán aínda están moi por enriba do TLV de UFC/m3 proposto por Dinamarca. Mofos. Os mofos mostráronse cun impactador de Andersen de 6 niveis conectado a unha bomba que funcionaba a un caudal de 28'3 litro/min. As mostraxes, de 2 minutos de duración, realizáronse, igual que para as bacterias, tres veces nun período de 4 horas. O medio de cultivo utilizado foi ágar de rosa bengala con cloranfenicol (50 mg/litro) para evitar o crecemento de bacterias. As placas incubáronse a 30º C durante 5 días. A identificación baseouse en observacións macroscópicas e microscópicas. Como control tomáronse mostras no exterior do edificio. Nun traballo realizado en leiterías, autores deste mesmo equipo (Duchaine et alii, 1999) utilizaron outros medios de cultivo específicos para fungos: ágar de dextrosa Sabouraud e ágar solución Czapaek. O tempo de cultivo dos fungos nestes medios foi de 7 e 10 días, respectivamente. Non se atoparon variacións significativas nos valores obtidos nas diferentes estacións. O valor medio achado foi de 883 UFC/m 3 (547 a UFC/m 3 ), e as especies máis importantes: Penicillium spp., Aspergillus spp., Scopulariopsis spp., Paccilomyces spp., Acremonium spp., Trichoderma spp., Zygomycetos spp. Actinomicetos termófilos e Saccharopolyspora rectivirgula. Ao igual que os mofos mostráronse con impactador de Andersen, co mesmo caudal, pero durante 20 min. As mostras tamén se tomaron tres veces no período de 4 h. As placas utilizadas contiñan medio TSA con cicloheximida (500 mg/litro) para evitar o crecemento de mofos. O cultivo destas placas levouse a cabo a 52º C durante 5 días. Unha vez finalizado o cultivo contáronse as colonias de actinomicetos termófilos e, usando as características de crecemento, 320

301 CASOS PRÁCTICOS. EXEMPLOS DE MOSTRAXE DOS AXENTES BIOLÓXICOS TOMADOS DA BIBLIOGRAFÍA determinouse a presenza de Saccharopolyspora rectivirgula (responsable da enfermidade coñecida como pulmón do granxeiro ). O reconto de actinomicetos termófilos e de S. rectivirgula deu niveis baixos, 29 UFC/m 3 (3 a 94 UFC/m 3 ), e non se observou variación estacional. Endotoxinas. Para a mostraxe de endotoxinas utilizouse un burbullador en medio líquido AGI-30 (igual que para as bacterias). As mostras conxeláronse a -20º C ata a súa análise. As endotoxinas analizáronse co ensaio do lisado de amebocitos de Limulus (Limulus amoebocyte assay, LAL) e o test cromoxénico do punto final (Endpoint Chromogenic Test). Como controis empregouse disolución salina con 0,05% de Tween 80 coa que se lavarán os AGI-30 durante uns minutos. Este procedemento permite detectar a contaminación inicial do material e das mostras. Os niveis de endotoxinas atopados foron elevados, 4'9 x 10 3 EU/m 3, moi superiores ao valor de 50 EU/m3 proposto como límite de exposición. Outros autores (Rask-Andersen et alii, 1989; Milton et alii, 1990 e Hollander et alii, 1993) utilizan o método de filtración para a mostraxe de endotoxinas. Os filtros utilizados, os caudais e tempos de mostraxe, así como o líquido para a extracción varían duns investigadores a outros. FUNGOS EN GRANXAS DE VACAS. Rauno Hanhela et alii (1995) estudan os fungos presentes no aire de granxas de vacas (leiterías). Para a análise de esporas totais empregaron filtros de policarbonato de 37 mm f con tamaño de poro de 0'4 mm, a un caudal de 20 litro/min. O tempo de mostraxe variou entre 1'5 e 4 horas. As esporas viables mostráronas con un impactador de Andersen de 6 niveis a un caudal de 28'3 litro/min. Neste caso, a mostraxe levouse a cabo durante un tempo comprendido entre 42 e 106 segundos. 321

302 CASOS PRÁCTICOS. EXEMPLOS DE MOSTRAXE DOS AXENTES BIOLÓXICOS TOMADOS DA BIBLIOGRAFÍA Os fungos (do filtro) mesófilos e termófilos cultiváronse sobre ágar de Malta. Incubáronse a 25º C de 5 a 7 días, os mesófilos, e a 40º C de 3 a 4 días, os termófilos. Os fungos xerófilos (do filtro) cultiváronse en ágar DG 18 (Dichloranglycerol agar) e incubáronse a 25º C durante 5-7 días. Aos medios de cultivo anteriores engadíronselles 100 mg/litro de cloranfenicol para evitar o crecemento de bacterias. As esporas totais e as viables analizáronse polo método CAMNEA (Parlington U. et alii 1983) (Collection of airborne microorganismos on nucleopore filters, estimation and analysis). As partículas en suspensión procedentes das mostraxes por filtración tinguíronse con laranxa de acridina e as esporas contáronse utilizando un microscopio de epifluorescencia. Contáronse conxuntamente as esporas de fungos e de actinomicetos. As mostras procedentes do impactador de Andersen foron recollidas sobre ágar de Malta e ágar HAGEM (ágar maltaglicosa-rosa bengala) para analizar os fungos mesófilos e termófilos, e sobre ágar de cloruro sódico-malta (10% NaCl) para os xerófilos. Os dous medios contiñan 35 mg/litro de estreptomicina para inhibir o crecemento bacteriano. Para o cálculo das esporas viables aplicouse a fórmula para corrixir a probabilidade de que máis dunha espora incidise no mesmo punto no medio de cultivo. Os fermentos contáronse separadamente, e a identificación dos diferentes xéneros de fungos realizouse por microscopía óptica. Os resultados mostran que a concentración de esporas, tanto as viables como as totais, é moi variable. Nesta variabilidade inflúen tanto o método de mostraxe, como o utilizado para o reconto. Os datos obtidos, expresados como UFC/m 3 son os seguintes: para fungos mesófilos, de 200 a 1'7 x 10 6 ; para os fungos xerófilos, entre 1'2 x 10 3 e 1'4 x 10 7 ; e para os fungos termófilos entre 20 e 1'5 x10 5. As esporas totais oscilaban entre 5'6 x 10 5 e 4'0 x 10 7 UFC/m

303 CASOS PRÁCTICOS. EXEMPLOS DE MOSTRAXE DOS AXENTES BIOLÓXICOS TOMADOS DA BIBLIOGRAFÍA As especies de fungos máis abundantes foron Aspergillus spp. (A. glaucus e A. fumigatus), Penicillium spp., Cladosporium spp., fermentos, Acremonium spp., Wallemia sebi, Absidia spp., Paecilomyces spp. e Mucor spp. Nesta experiencia tamén tomaron mostras dos materiais utilizados como comida e bebida que pesaron e homoxeneizaron nunha dilución en auga de 1 g/litro de peptona, con 0'01% de Tween 80. Tras unha hora de axitación, tomaron alícuotas das suspensións anteriores que se sementaron en placas con ágar extracto de malta, para os fungos mesófilos e termófilos, e en ágar DG18 para os fungos xerófilos, como se indicou arriba. BACTERIAS, FUNGOS E ENDOTOXINAS EN SERRADOIROS DE MADERA. Caroline Duchaine et alii (2000 b) estudan entre outros contaminantes os bioaerosois presentes nos serradoiros de diversos tipos de madeiras en Canadá, rexión de Quebec. O seu maior interese céntrase en avaliar os bioaerosois presentes nos serradoiros e determinar o tipo de especies fúnxicas que forman parte da microflora destes ambientes. O estudo compara a microflora atopada na rexión de Quebec coa atopada en diferentes países europeos. Para a toma de mostras utilizaron un impactador Andersen de 6 niveis e burbulladores AGI-30. Os medios de cultivo empregados son: ágar soia tripticasa (TSA) suplementado con 500 mg/l de cicloheximina para a mostraxe de actinomicetos termófilos e bacterias mesófilas; ágar nutriente de dureza media (1/2 N) para actinomicetos termófilos; ágar dextrosa Sabouraud (SDA) e ágar rosa bengala (RB) para a mostraxe de fungos e fermentos; e o ágar solución Czapek (CZA) suplementada con 50 mg/l de cloranfenicol, para a mostraxe de fungos. O burbullador foi cargado con 20 ml de solución salina ao 0'85%. O tempo de mostraxe empregado depende do tipo de microorganismo que se desexa captar. Co impactador de Andersen, a un caudal de 28'3 L/min., mostrouse durante 20 minutos para actinomicetos termófilos e 1 minuto para bac- 323

304 CASOS PRÁCTICOS. EXEMPLOS DE MOSTRAXE DOS AXENTES BIOLÓXICOS TOMADOS DA BIBLIOGRAFÍA terias; e 30 segundos para fungos e fermentos. As mostraxes realizadas co burbullador AGI-30, a un fluxo de 12'5 L/min., duraron 16 minutos. As mostras de control tomáronse no exterior dos serradoiros a unha distancia comprendida entre 1 e 5 quilómetros. As mostras tomadas en TSA e 1/2 N incubáronse a 52º C entre 5 e 7 días para determinar actinomicetos termófilos e a 30º C durante 48 horas para bacterias mesófilas. As mostras SDA, RB e CZA incubáronse a 30º C entre 7 e 10 días. As mostras do AGI diluíronse en series de ata 10-5 e cultiváronse nos mesmos medios anteriores. Realizouse o reconto de colonias de bacterias, actinomicetos termófilos e fungos. As distintas colonias de mofos diferenciables macroscopicamente foron cultivadas en SDA para a súa posterior identificación. As endotoxinas das mostras de AGI medíronse usando o test cromoxénico do punto final de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Entre a microflora que atopan, os fungos do xénero Penicillium son os máis abundantes con concentracións que alcanzan altos niveis nalgúns postos de traballo, seguidos das especies do xénero Trichoderna. Os valores atopados son do mesmo nivel dos que aparecen en cortes de vacas e granxas de porcos. Estas especies son diferentes das atopadas por outros autores en Europa, en onde predominan os xéneros Rhizopus, Paecilomyces, Aspergillus e Mucor. A maior contaminación de mofos (1'5 x 106 UFC/m 3 ), bacterias ( UFC/m 3 ) e endotoxinas (1.081 unidades/m 3 ) atopáronse no posto de descortizado. Os autores conclúen que a concentración e os tipos de mofos atopados suxiren a necesidade de avaliar os efectos desta contaminación ambiental no sistema respiratorio dos traballadores afectados. 324

305 CASOS PRÁCTICOS. EXEMPLOS DE MOSTRAXE DOS AXENTES BIOLÓXICOS TOMADOS DA BIBLIOGRAFÍA BACTERIAS E FUNGOS NUNHA PLANTA DE COMPOSTAXE Rosa Mª Alonso et alii (2001) estudaron a concentración ambiental de bacterias e fungos en diferentes etapas do proceso de compostaxe co fin de avaliar a exposición laboral. Para mostrar as bacterias utilizaron un mostrador SAS, utilizando como soporte placas RODAC de 55 mm de diámetro. O medio de cultivo empregado foi TSA (Tryptic Soy Agar). As placas incubáronse a 37º C durante 48 horas. A mostraxe dos fungos realizárona cun analizador M Air T de Millipore, utilizando como soporte placas Petri de 90 mm. Como medio de cultivo empregaron rosa bengala. Neste caso, as placas incubáronse a 25º C durante 5 días. Os autores realizaron un illamento selectivo das diferentes colonias de fungos en función da forma, cor e produción de pigmentos. Sementaron as colonias en placas de Petri con ágar Sabouraud e incubáronas a 25º C durante 5 días. A identifición realizárona observando co microscopio as formas reprodutoras. Deste estudo conclúese que tanto as bacterias como os fungos están presentes en todo o proceso de compostaxe, tanto na zona de compostaxe propiamente dita coma na zona de preparación das mesturas. Non obstante, a concentración ambiental de fungos e, sobre todo, de bacterias é máis elevada na primeira fase da compostaxe (fase termófila) que na segunda, fase mesófila. Nalgunhas fases do proceso atoparon concentracións de bacterias superiores ás UFC/m 3, mentres que os fungos tamén superaron as UFC/m 3. Os xéneros de fungos atopados foron: Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Rhizopus e Cladosporium. 325

306 CASOS PRÁCTICOS. EXEMPLOS DE MOSTRAXE DOS AXENTES BIOLÓXICOS TOMADOS DA BIBLIOGRAFÍA FUNGOS E SÍNDROME DO EDIFICIO ENFERMO Cooley et alii (1998) estudaron a relación existente entre a presenza de certas especies de fungos e a síndrome do edificio enfermo. Realizaron unha mostraxe do aire utilizando un impactador de Andersen de 2 niveis. As mostras tomáronse durante 5 minutos a un caudal de 28,4 L/min. O medio que se utilizou nas placas do impactador foi ágar de dextrosa Sabouraud, a ph 5'6. As mostras incubáronse a 22º C durante 14 días. O resultado do reconto das devanditas placas expresouse como UFC/m3. Tamén se tomaron mostras en superficie naquelas áreas en que o crecemento era visible. As bólas utilizadas foron introducidas en bolsas de plástico estériles para envialas ao laboratorio. Alí, introducíronse nun tubo estéril con 10 ml de tampón salino fosfato e axitouse vigorosamente durante 1 minuto. Destas solucións tomáronse 100 µlitro que se sementaron sobre as placas co mesmo medio de cultivo e baixo as mesmas condicións que se sinalaron para as placas do impactador de Andersen. O resultado expresouse en UFC (unidades formadoras de colonias) e o crecemento cualificouse como nulo (0 UFC), moi lixeiro (1-5 UFC), lixeiro (6-10 UFC), medio (11-30 UFC), elevado (31-50 UFC) e moi elevado (>50 UFC). Os fungos illados foron identificados por técnicas estándar. Dos fungos atopados, só cinco xéneros constituían o 95% dos que existen no aire exterior: Cladosporium (81,5%), Penicillium (5,2%), Chrysosporium (4,9%), Alternaria (2,8%) e Aspergillus (1,1%). A presenza do xénero Cladosporium era menor no interior dos edificios, especialmente naqueles nos que non existían queixas, que no aire exterior. Penicillium spp. e Aspergillus spp. foron as únicas especies illadas dos edificios nos que se recibiran queixas por parte dos ocupantes, que aparecían en concentracións significativamente maiores que no aire exterior ou nos edificios sen queixas. 326

307 CASOS PRÁCTICOS. EXEMPLOS DE MOSTRAXE DOS AXENTES BIOLÓXICOS TOMADOS DA BIBLIOGRAFÍA As mostras de superficie permitiron poñer de manifesto áreas de crecemento de Stachybotrys ata que, non obstante, non conseguiu illarse das mostras ambientais. Tamén se detectaron áreas cun crecemento elevado ou moi elevado de Penicillium spp. e Aspergillus spp. Os traballos anteriores serven para mostrar a utilización que se pode facer dalgúns dos métodos de toma de mostra, análise e valoración dun ambiente con respecto a contaminantes biolóxicos. Cada investigador elixe, entre todos os dispoñibles, o tipo de mostrador e os medios de cultivo que, ao seu xuízo, lle van ofrecer mellores resultados. A oferta é ampla, polo tanto, mentres non se establezan uns métodos de análises e identificación estandarizados, o hixienista pode recorrer a calquera método validado para a identificación e reconto de microorganismos, así como os distintos medios de cultivo, xerais ou específicos, que mellor respondan ás súas necesidades. Os puntos de mostraxe e a duración desta, así como o número de mostras, estableceranse para cada caso concreto, atendendo ás premisas que indicamos ao falar da mostraxe de fungos e bacterias. 327

308 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO

309 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO Altmeyer, N.; Abdía, G.; Schmitt, S e Leprince, A. (1990). Risques microbiologiques et travail dans les stations d epuration des eaux usées, Documents pour la médecin du travail, nº 44. Aizenberg, V.; Grinshpun, S.A.; Willeke, K.; Smith, J. e Baron, P.A. (2000a). Performance characteristics of the button personal inhalable aerosol sampler, Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 61: Aizenberg, V.; Reponen, T; Grinshpun, S.A. e Willeke, K. (2000b). Performance of Air-O-Cell, Burkard, and Button samplers for total enumeration of airborne spores, Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 61: Alonso, R.M.; Solans, X. e Constans, A. (2001). Evaluación ambiental de agentes biológicos en una planta de compostaje, Comunicación al XII Congreso Nacional de Seguridad y Salud en el Trabajo. Valencia de novembro. American Industrial Hygiene Association (1996). Field guide for the determination of biological contaminants in enviromental samples, Edit. Dillon, H. K.; Heinsohn, P. A. e Miller, J. D.. Virginia: 174 pp. Andersen, A. A. (1958). New Sampler for the collection, sizing and enumeration of viable inhaled particles, J. Bact. 76: Andrup, L.; Nielsen, B. H. e Kolvraa, S. (1990). Biosafety considerations in industries with production methods based on the use of recombinant deoxyribonucleic acid, Scand. J. Work Environ. Health 16: de Arquer, M. I.; Gadea, E.; Guardino, X.; Hernández, A.; Luna, P.; Martí, M. C.; Martín, F; Nogareda, C.; Nogareda, S.; Piqué, T.; Rosell, M. G.; Solé, M. D.; Heras, C.; Caballero, J. D. (2000). Condiciones de trabajo en centros sanitarios, Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 529 pp. 331

310 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO Autrup, J. L.; Schmidt, J.; Seremet, T. e Autrupp, H. (1991). Determination of exposusre to aflatoxins among Danish workers in animal feed production through the analysis of aflatoxin B1 adducts to serum albumin, Scand. J.Work, Environ. Health Berenguer, M. J.; Guardino, X.; Hernández, A.; Martí, M. C.; Nogareda, C.; Solé, M. D. (1994). El síndrome del edificio enfermo. Metodología de Evaluación, Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo, Madrid: 149 pp. Berenguer, M.J. (1991). NTP-289. Síndrome del Edificio Enfermo: factores de riesgo. Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 8 pp Chang, C-W.; Grinshpun, S.A.; Willeke, K.; Macher, J. M.; Donnelly, J.; Clark, S. e Juozaitis, A. (1995). Factors affecting microbiological colony count accuracy for bioaerosol sampling and analysis. Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 56: Clarck, S.; Rylander, R. e Larsson, L. (1983). Airborne bacteria, endotoxin and fungi in dust in poultry and swine confinement buildings, Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 44: Comité Européen de Normalisation (CEN) (1993). Workplace atmospheres. Size fraction definition procedures for measurement of airborne particles in the workplace (EN 481) Constans, A; Alonso, R.M. e Martí, M.C. (1998) NTP- 473.Estación depuradora de aguas residuales: riesgo biológico. Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 5pp Cooley, D. J.; Wong, W. C.; Jumper, C. A. e Straus, D. C. (1998). Correlation between the prevalence of certain fungi and sick building syndrome, Occup. Environ. Med. 55: Cormier, Y.; Tremblay, G.; Meriaux, A.; Brochu, G. e Lavoie, J. (1990). Airborne microbial contents in two types of swine 332

311 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO confinement buildings in Quebec, Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 51: Demers, P. e Teschke, K. (1999). Industria de la madera, en Enciclopedia de la seguridad y salud en el trabajo de la OIT, 3ª Edición. Publica Ministerio de Trabajo y Asuntos Sociales: DHHS-NIOSH (1997a). Preventing asthma in animal handlers, Publication nº DHHS-NIOSH (1997b). Histoplasmosis: protecting workers at risk, Publication nº DHHS-NIOSH (1999). Cercopithecine herpesvirus 1 (B virus) Infection Resulting from Ocular Exposure, Publication nº DHHS-NIOSH Publications (1998). NIOSH manual of analytical methods. (4ª Edición). Editor Eller P. M. y Cassinelli, M. E. Cincinnati. Donham, K. (1999). Confinamiento del ganado, en Enciclopedia de la seguridad y salud en el trabajo de la OIT, 3ª Edición. Publica Ministerio de Trabajo y Asuntos Sociales: Duchaine, C.; Grimard, Y. e Cormier, Y. (2000a). Influence of building maintenance, environmental factors, and seasons on airborne contaminants of swine confinements buildinds, Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 61: Duchaine, C.; Mériaux, A.; Brochu, G. e Cormier, Y. (1999). Airborne microflora in Quebec dairy farms: Lack of effect of bacterial hay preservatives, Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 60: Duchaine, C.; Mériaux, A.; Thorne, P. S. e Cormier, Y. (2000b). Assessment od particulates and bioaerosols in eastern canadian sawmills, Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 61:

312 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO Dulbecco, R. e Ginsberg, H. S. (1984a). Multiplicación y genética de los virus animales, en Tratado de microbiología, Salvat editores S.A.: Dulbecco, R. e Ginsberg, H. S. (1984b). Patogénesis de las infecciones víricas, en Tratado de microbiología, Salvat editores S.A.: Eduard, W. (2003). The performance of culture-based methods and microscopy for quantification of non-infectious airborne microorganisms in epidemiological studies of highly contaminated work environments, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 64: Eduard, W. e Heederik D. (1998). Methods for quantitative assessment of airbone levels of noninfectious microorganisms in highly contaminated work enviroments, Am. Ind. Hyg. Ass. J. 59: Eduard, W.; Lacey, J.; Karlsson, K.; Palmgren, U.; Ström, G. e Blomquist, G. (1990). Evaluation of methods for enumerating microorganisms in filter samples from highly contaminated occupational environments, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 51: Elms, J.; Beckett, P.; Griffin, P.; Evans, P.; Sams, C.; Roff, M. e Curran, A.D. (2003). Job ccategories and their effect on exposure to fungal alpha-amylase and inhalable dust in the U.K. baking industry,, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 64: Gestal, J.J. (1989). Riesgos del trabajo del personal sanitario. McGrawn-Hill, Interamericana de España: 831 pp Guillespie, V. L.; Clark, C. S.; Bjornson, H. S.; Samuels, S. J. e Holland, J. W. (1981). A comparison of two-stage and sixstage Andersen impactors for viable aerosols, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 42: Gots, R.E. ; Layton, N. J. e Pirages, S.W. (2003). Indoor health : background levels of fungi,, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 64:

313 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO Hanhela, R.; Louhelainen, K. e Pasanen, A.-L. (1995). Prevalence of microfungi in Finnish cow barns and some aspects of the occurrence of Wallemia sebi and Fusaria, Scand. J. Work Environ. Health 21: Hauck, B. C.; Grinshpun, S.A.; Reponen, A.; Reponen, T.; Willeke, K. e Bornschein, R. L. (1997). Field testing of new aerosol sampling method with a porous curved surface as inlet, Am. Ind. Hyg. Assoc. J., 58: Hernández, A. (1996). NTP-409. Contaminantes biológicos: criterios de valoración, Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 5pp Hernández, A. (2003). NTP-608. Agentes biológicos: planificación de la medición, Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 18pp Hollander, A.; Heederik, D.; Versloot, P. e Douwes, J. (1993). Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 54: Husman, T. (1996). Health effects of indoor-air microorganisms, Scand. J. Work Environ. Health 22: 5-13 IARC (2004). Overall evaluations of carcinogenicity to humans. http//monographs.iarc.fr/monoeval/crthall.html Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el trabajo, INSHT, (2003). Guia técnica para la evaluación y prevención de los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos, 3ª edición. Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 78 pp International Organization for Standardization (ISO) (1995). Air quality particle size fraction definitions for health-related sampling (ISO 7708) Ivens, U. I.; Breum, N. O.; EbbehØj, N.; Nielsen, B. H.; Poulsen, O. M.; Würtz, H. (1999). Exposure-response relationship between gastrointestinal problems among waste 335

314 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO collectors and bioaerosol exposure, Scand. J. Work Environ. Health 25: Jimeno, A.; Ballesteros, M.; Pardo, A.; Ugedo, L. (1983). Biología, Editorial Santillana S.A. Madrid: 462 pp. Jones, W.; Morring, K.; Morey, P. e Sorenson, W. (1985). Evaluation of the Andersen viable impactor for single stage sampling, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 46: Karlsson, K. e Malmberg, P. (1989). Characterization of exposure to molds and actinomycetes in agricultural dusts by scanning electron microscopy, fluorescence microscopy and th culture method, Scand. J. Work Environ. Health 15: Kenny, L. C.; Stancliffe, J. D.; Crook, B.; Stagg, S.; Griffiths, W.D.; Stewart, I.W. e Futter, S. J. (1998). The adaptation of exixting personal inhalable aerosol samplers for bioiaerosol sampling, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 59: Kobayashi, G. S. (1984). Hongos, en Tratado de microbiología, Salvat editores S.A.: Kotimaa, M. H.; Oksanen, L.; Koskela, P. (1991). Feeding and bedding materials as sources of microbial exposure on dairy farms, Scand. J. Work Environ. Health 17: Laborda, R. (1993). NTP-317. Fluidos de corte, criterios de control de riesgos higiénicos. Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 6 pp Lee, S. B. e Johnson, B. (1997). Biohazards in the work environment, en The occupational environment - its evaluation and control, editado por DiNardi, S. R.; AIHA Press, Virginia: Leopold, S. S. (1988). Positive hole statistical adjustment for a two-stage, 200-hole-per-stage Andersen air samler, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 49: A88-A90 336

315 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO Macher, J. M. (1989). Positive-hole correlation of multiple-jet impactors for collecting viable microorganisms, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 50: Macher, J. M. e First, M. W. (1983). Reuter centrifugal air sampler: measurement of effective airflow rate and collection efficiency, Appl. Environ. Microbiol. 45: Macher, J. M. e First, M. W. (1984). Personal air samplers for measuring occupational exposures to biological hazards, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 45: Macher, J. M. e Hansson, H.-C. (1987). Personal size-separating impactor for sampling microbiological aerosols, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 48: Martí, M.C.; Alonso, R.M. e Constans, A. (1994). NTP-351. Micotoxinas (aflatoxinas y tricotecenos) en ambientes laborales. Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 4pp Martí, M.C.; Alonso, R.M. e Constans, A. (1996). NTP-429. Desinfectantes: características y usos más corrientes. Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 4pp Martí, M.C.; Alonso, R.M. e Constans, A. (1998). NTP-488. Calidad del aire interior: identificación de riesgos. Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 4pp Martí, M.C.; Alonso, R.M. e Constans, A. (2000 a). NTP-571. Exposición a agentes biológicos: equipos de protección individual. Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 6pp Martí, M.C.; Alonso, R.M. e Constans, A. (2000 b). NTP-572. Exposición a agentes biológicos: la gestión de los equipos de protección individual en los centros sanitarios. Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 6pp 337

316 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO Martí, M. C.; Alonso, R. M.; Constans, A.; Guardino, X. (1997). Prevención de riesgos biológicos en el laboratorio, Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo: 169 pp Martí, M.C. e Obiols, J. (1991). NTP-288. Síndrome del Edificio Enfermo: enfermedades relacionadas y papael delos bioaerosoles. Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo. Madrid: 6 pp Miller, C. D.; Songer, J. R. e Sullivan, J. F. (1987). A twenty-five year review of laboratory-adquired human infections at the National Animal Disease Center, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 48: Milton, D. K.; Gere, R. J.; Feldman, H. A. e Greaves, I. A. (1990). Endotoxin measurement: aerosol sampling and application of a new Limulus method, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 51: Morring, K.L.; Sorenson, W. G. e Attfield, M.D. (1983). Sampling for airborne fungi: A statistical comparison of media, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 44(9): National Institute for Occupational Safety and Health (1998). NIOSH manual of analytical methods, 4ª Edition, DHHS (NIOSH) Publication No ; Ed. Cassinelli, M. E. Cincinnati, Ohio. Norma UNE-EN (2001). Atmósferas en el lugar de trabajo. Directrices para la medición de microorganismos y endotoxinas en suspensión en el aire. Editada por AENOR, Madrid: 29 pp Olenchock, S. A.; Lewis, D. M. e Mull, J. C. (1989). Effects of different extraction protocols on endotoxin analyses of airborne grain dusts, Scand. J. Work Environ. Health 15: Occupational Safety and Health Administration, OSHA (1999).Technical manual TED 1-O.15. Edita Occupational 338

317 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO Safety and Health Administration, Salt Lake City, UTAH: OMS (2003) Laboratory biosafety manual 2ª edition. Publica World Health Organization, Geneva: 99 pp Palmgren, U.; Ström, G.; Blomquist, G.; Malmberg, P. (1986). Collection of airborne micoorganisms on Nucleopore filters, estimation and analysis - CAMNEA method, J. Appl. Bacteriol. 61: Ramos, C. (1999). Riesgos biológicos en personal sanitario. Programas de prevención, Edita Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo, Madrid: 51 pp. Rappaport, S. M.; Kromhout, H. e Symanski, E. (1993). Variation of esposure between workers in homogeneous exposure groups, Am Ind. Hyg. Assoc. J. 54: Rask-Andersen, A.; Malmberg, P. e Lundholm, M. (1989). Endotoxin levels in farming: absence of symptoms despite high exposure levels, Br. J. Ind. Med. 46: Rautiala, S.; Kangas, J.; Louhelainen, K. e Reiman, M. (2003). Farmers exposure to airborne microorganisms in composting swine confinement buildings, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 64: Roy, E. e Robillard, P. (1994). Effectiveness of a compliance to preventive measures against the occupational transmission of human immunodeficiency virus, Scand. J. Work Environ. Health 20: Rubow, K. L.; Marple, V. A.; Olin, J. e McCawlwy, M. A. (1987). A personal cascade impactor: design, evaluation and calibration, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 48: Rylander, R. (1994). Organic dust - from knowledge to prevention, Scand. J. Work Environ. Health 20, special issue:

318 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO Shelton, B. G.; Kerbel, W.; Witherell, L. e Millar, J. D. (2000). Review of legionnaires disease, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 61: Simmons, R. B.; Price, D. L.; Noble, J. A.; Crow, S. A. e Ahearn, D. G. (1997). Fungal colonization of air filters from hospitals, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 58: Smid, T.; Schokkin, E.; Boleij, J. S. M. e Heederik, D. (1989). Enumeration of viable fungi in occupational environments: a comparison of samplers and media, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 50: Spicer, R. C. e Gangloff, H. J. (2000). Limitations in application of Spearman s rank correlation to bioaerosol sampling data, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 61: Stanevich, R. e Petersen, M. (1990). Effect of sampling time on airborne fungal collection, Proc. Ind. Air Qual. 90: Thorne, P. S.; Lange, J. L.; Bloebaum, P. e Kullman, G. J. (1994). Bioaerosol sampling in field studies: Can samples be express mailed?, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 55: Thorne, P. S.; DeKoster, J. A. e Subramanian, P. (1996). Environmental assessement of aerosols, bioaerosols y airborne endotoxins in a machining plant, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 57: Trout, D.; Gomez, T.M.; Bernard, B.P.; Mueller, C.A.; Smith, C.G.; Hunter, L. e Kiefer, M. (1995).Outbreak of brucellosis at a United States pork packing plant, J. Occup. And Environ. Med. 37: Wood, W. B. y Davis, B. D. (1984). Relaciones parásito huésped en las infecciones bacterianas, en Tratado de microbiología, Salvat editores S.A.: Woskie, S. R.; Virji, M. A.; Kriebel, D.; Sama, S. R.; Eberiel, D.; Milton, D. K.; Hammond, S. K. y Moure-Eraso, R. (1996). Exposure assessment for a field investigation of the acute 340

319 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO respiratory effects of methalworking fluids. I. Summary of findings, Am. Ind. Hyg. Assoc. J. 57: Xunta de Galicia (1998).Guía de Avaliación de Riscos Laborais. 45 pp 341

320 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO ANEXO REAL DECRETO 664/1997, do 12 de maio, sobre a protección dos traballadores contra os riscos relacionados coa exposición a axentes biolóxicos durante o traballo. ORDE do 25 de marzo de 1998 pola que se adapta en función do progreso técnico o Real decreto 664/

321 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 344

322 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 345

323 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 346

324 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 347

325 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 348

326 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 349

327 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 350

328 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 351

329 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 352

330 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 353

331 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 354

332 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 355

333 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 356

334 BIBLIOGRAFÍA E ANEXO 357